細胞外囊泡 (EV) 在過去十年中取得了快速發(fā)展，在其起源、疾病相關性以及診斷和治療等方面已有諸多的發(fā)現(xiàn)與報道。在這些研究領域中，對 EV 的全面表征至關重要，需要涵蓋EV單顆粒及整體分析，例如粒度，電位，濃度，粒徑分布，以及檢測與 EV 相關的特征蛋白，例如 CD9、CD63、CD81、Alix 和 TSG1012-5。如果想對EV的表型進行更深入的分析，則須利用Western blotting、ELISA 或單囊泡/整體免疫標記等方法進行EV表型分析。
目前，還沒有一種方法可以將單個囊泡上的蛋白質檢測與整體粒度分布和濃度測量相結合。納米顆粒追蹤分析 (NTA) 是一種應用于表征 EV 粒度分布的技術。NTA 基于斯托克斯-愛因斯坦方程，通過追蹤單個顆粒的布朗運動來確定單個 EV 和 EV 群體的尺寸。NTA 利用激光照射顆粒，理論上可以實現(xiàn)熒光染料的特異性激發(fā)和檢測熒光標記的 EV (NTA-FL)。然而，目前只有少數(shù)研究對 NTA-FL 進行了嚴格的評估，并且這些研究依賴于非典型 EV 蛋白靶標或非特異性標記的免疫標記。
美國塔夫斯大學 (Tufts University) 的研究人員們報道了一種熒光免疫標記單個 EV 用于 NTA-FL 的優(yōu)化算法，使得基于NTA的單囊泡免疫標記和檢測與粒度分布和濃度分析更為精準。該算法可以有效地提高NTA檢測結果可信度，為更深入研究 EV 的功能和機制提供了強有力的工具。
在前期研究中，研究人員們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的利用NTA進行EV亞型分析的熒光/散射光比對方法會出現(xiàn)數(shù)據(jù)偏離的情況。通常情況，熒光 (FM) 曲線所圍繞的面積與散射光 (LSM) 曲線所圍繞成的面積的比值可以表示EV的純度。但是這些研究人員們在分析過程中發(fā)現(xiàn)，在測試1，2，4中（表1，圖1），F(xiàn)M（藍線)與LSM（紅線）的比值大于100%，表明EV純度大于100%，這顯然是不合理的，這種測試結果表明：1. 熒光檢測過程中，可能出現(xiàn)了大量的假信號。
2. NTA 系統(tǒng)的技術限制導致 LSM 無法檢測到非常小的 EV 或折射率低的其他顆粒。散射光模式下EV檢測不全，有部分EV數(shù)據(jù)沒有檢測到，使得LSM面積偏小，從而導致比值大于100%。
3. 研究人員還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)M模式在50 nm以下的區(qū)域還有明顯的信號峰出現(xiàn)，而對比LSM模式，其在50 nm以下信號基本衰減為0，這可能也是造成比值大于100%的原因之一。具體而言，這可能是游離的熒光分子沒有充分去除，以及體系中游離的蛋白質被熒光分子標記，造成小尺寸分區(qū)中的熒光信號增強。
表1 不同樣本的熒光面積（FM）與散射光面積（LSM）比值圖1 不同樣本在FM模式及LSM模式下NTA測試結果
為了解決這種情況，研究人員們提出了兩種評估方法：
第一種方法是傳統(tǒng)的計算方法，即計算樣本中大于 50 nm的顆粒數(shù)量，并比較 FM 和 LSM 中的顆粒數(shù)量，得出 FM 與 LSM 之間的比例。（圖2b，c）
第二種方法是優(yōu)化后的計算方法，計算兩種方法得到的粒度分布曲線之間的重疊區(qū)域，并將該區(qū)域與 LSM 中大于 50 納米的顆粒總數(shù)量進行比較，得出重疊區(qū)域比例。（圖2d）
在研究過程中，研究人員著重強調了他們對顆粒粒徑選取的取舍。為了更精確地分析 EV，研究人員將分析范圍縮小到 50-200 納米。之所以選擇這個范圍，是因為大多數(shù) EV 的尺寸都在這個范圍內。此外，LSM對小于 50 納米的顆粒檢測能力有限，而大于 200 納米的顆粒則可能并非 EV。因此，將分析范圍縮小到 50-200 納米可以有效地排除其他類型的顆粒，提高分析結果的準確性。
圖2 基于NTA的免疫標記算法示意圖
基于這種優(yōu)化算法，研究人員對上述6組樣本的數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)結果表明EV純度都回落至小于100%。
表2 算法優(yōu)化后不同樣本的熒光面積 (FM) 與散射光面積 (LSM) 比值（SA）
上述算法利用量子點標記和 NTA-FL 技術，通過比較熒光模式 (FM) 和散射光模式 (LSM) 的結果，可以有效識別和分析在單個囊泡層面的不同亞型的 EV，并提供更精確的粒度分布信息。然而，盡管NTA-FL技術和優(yōu)化算法可以有效提高EV亞型分析的準確性，但也必須認識到NTA技術在底層原理上存在一些局限性。NTA在檢測非常小的EV或粒徑分布寬的樣本（尤其是EV樣本）時存在一定的困難。因此，雖然NTA-FL技術和優(yōu)化算法可以提高粒度分布和濃度分析的準確性，但NTA的技術瓶頸并未得到克服，后續(xù)的算法優(yōu)化以及熒光標記方法能否在錯誤的基礎上得到正確的結果仍需謹慎對待，以免過分依賴這一技術所得到的數(shù)據(jù)。NanoCoulter納米粒度儀采用庫爾特原理，打破了光學原理的局限性，可以精準分析每個過孔顆粒，實現(xiàn)真正意義上的單顆粒檢測，對粒徑分布廣的多分散系樣本有更好的測量效果。且不受樣本的折射率、吸光度等光學性質影響，數(shù)據(jù)不擬合，最真實的反應樣本狀態(tài)。
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