檢測(cè)限 (LOD, Limit of Detection) 是指分析方法能夠可靠檢測(cè)到的最小物質(zhì)濃度或數(shù)量，代表著方法的靈敏度。對(duì)于藥物遞送和納米載藥系統(tǒng)，準(zhǔn)確報(bào)告LOD不僅幫助確定檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，還關(guān)系到低濃度顆粒的檢測(cè)、監(jiān)管合規(guī)性（進(jìn)行藥品申報(bào)或質(zhì)量控制時(shí)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)如FDA、EMA等通常要求詳細(xì)報(bào)告顆粒表征方法的LOD）、方法驗(yàn)證，以及科研成果的可信度。那么，市場(chǎng)上的各種顆粒表征方法或儀器，能否提供準(zhǔn)確的LOD？它們的檢測(cè)原理和局限性是什么？接下來，和小編一起深入探討吧！
納米顆粒跟蹤分析（NTA）無法提供傳統(tǒng)意義上的LOD
納米顆粒跟蹤分析 (NTA, Nanoparticle Tracking Analysis) 是一種通過跟蹤并分析單個(gè)納米顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)來測(cè)量粒徑和濃度的技術(shù)。盡管NTA能夠提供納米顆粒的粒徑分布和濃度信息，但由于以下原因，它無法提供傳統(tǒng)意義上的LOD：
NTA依賴于光散射來檢測(cè)顆粒，而不同顆粒的散射強(qiáng)度差異較大，尤其是在樣品中存在多分散性時(shí)，大顆粒散射光強(qiáng)往往將小顆粒信號(hào)遮擋，導(dǎo)致粒徑偏大，濃度偏低。因此，不同粒徑的顆?？赡軙?huì)產(chǎn)生不同的信號(hào)強(qiáng)度，使得定義一個(gè)統(tǒng)一的LOD變得困難。
2、顆粒濃度影響：
NTA的檢測(cè)范圍受到顆粒濃度的限制。濃度過高時(shí)，大小顆粒之間的相互干擾會(huì)導(dǎo)致分析不準(zhǔn)確；濃度過低時(shí)，無法檢測(cè)到足夠數(shù)量的顆粒亦會(huì)造成取樣誤差和隨機(jī)誤差（。因此，很難確定一個(gè)適用于所有樣品的低濃度檢測(cè)限（不同的樣本的LOD會(huì)有所不同）。同時(shí)，即便是純化后的細(xì)胞外囊泡這類明確的樣本其線性濃度區(qū)間也通常只能集中于一個(gè)數(shù)量級(jí)[1][2]。
3、光學(xué)系統(tǒng)的限制：
NTA的檢測(cè)靈敏度還取決于光學(xué)系統(tǒng)的分辨能力以及參數(shù)設(shè)定，特別是在檢測(cè)小尺寸的納米顆粒時(shí)。光學(xué)分辨能力的局限使得難以為NTA技術(shù)定義一個(gè)統(tǒng)一的LOD。
由于這些因素，NTA在粒徑和濃度表征種提供的是一種相對(duì)定量的結(jié)果，而非絕對(duì)的低檢測(cè)限。
動(dòng)態(tài)光散射（DLS）的局限性
動(dòng)態(tài)光散射 (DLS，Dynamic Light Scattering) 本質(zhì)上是一種用于測(cè)量懸浮液中納米顆粒或大分子的擬合粒徑的方法。由于DLS依賴于顆粒散射光的強(qiáng)度，同樣的，在確定檢測(cè)限LOD上通常具有一定的局限性：
1、散射強(qiáng)度的依賴性：
DLS測(cè)量的是樣品中所有顆粒的平均布朗運(yùn)動(dòng)，因此，較小的顆粒或者低濃度的顆粒產(chǎn)生的散射信號(hào)可能被背景噪聲淹沒，難以準(zhǔn)確檢測(cè)。一般來說，DLS的LOD對(duì)于顆粒濃度和粒徑范圍的要求要比人們通常理解的要高。
2、多分散性和濃度影響：
在多分散體系或濃度過低的樣品中，DLS難以區(qū)分各個(gè)不同大小的顆粒，因此難以準(zhǔn)確給出一個(gè)統(tǒng)一的LOD。具體來說，DLS的原理假設(shè)樣本都是單分散大小分布的（PDI<0.1甚至要更?。?，而對(duì)于多分散的（例如大多數(shù)生物樣本）并不適合；另外雖然DLS原理并不能計(jì)算濃度數(shù)據(jù)，但是DLS測(cè)樣對(duì)濃度卻是有要求的，不合適的上樣濃度會(huì)導(dǎo)致粒徑上的巨大偏差，也容易被人忽視。
綜上，我們可以發(fā)現(xiàn)NTA和DLS均無法給出實(shí)際意義的LOD。這點(diǎn)在國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV，International Society for Extracellular Vesicles）發(fā)布的最新指南中也明確指出：需要公布檢測(cè)方法的LOD，從而允許其他人驗(yàn)證結(jié)果，而不管靈敏度限制如何。但目前尚無方法為納米顆粒跟蹤分析（NTA）、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）或成像流式細(xì)胞術(shù)得出可追溯的LOD[3]。
電阻脈沖感應(yīng)（RPS) 方法可以表示確定的LOD
電阻脈沖感應(yīng)（RPS，Resistive Pulse Sensing）方法在納米顆粒的粒徑和濃度表征中均可以給出確定的LOD。RPS通過檢測(cè)單個(gè)顆粒通過微孔時(shí)引起的電阻變化來測(cè)量顆粒的尺寸和數(shù)量。因?yàn)樗菃晤w粒檢測(cè)方法，RPS在某些條件下可以提供非常低的檢測(cè)限，尤其適合檢測(cè)稀釋樣品中的低濃度顆粒。LOD通常與微孔或納米孔的大小和樣品中的噪聲水平相關(guān)聯(lián)。
依賴孔徑大小：
LOD通常與微孔的大小和樣品中的噪聲水平相關(guān)聯(lián)。較小的孔徑可以檢測(cè)到較小的顆粒，但同時(shí)也可能增加背景噪聲，從而影響LOD的準(zhǔn)確性。
依賴噪聲水平：
樣品的電導(dǎo)性、孔道的表面特性以及背景電流的穩(wěn)定性都會(huì)影響檢測(cè)限。如果背景噪聲低，RPS可以檢測(cè)到非常小且低濃度的顆粒，從而實(shí)現(xiàn)較低的LOD。
瑞芯智造NanoCoulter納米庫爾特粒度儀應(yīng)用RPS技術(shù)，打破光學(xué)原理的局限性，經(jīng)過十余年微納加工技術(shù)沉淀，創(chuàng)新光刻硅基固體納米孔芯片，將經(jīng)典庫爾特技術(shù)的粒徑檢測(cè)范圍從微米級(jí)下探至納米級(jí)。同時(shí)依賴高靈敏皮安級(jí)電流檢測(cè)和信號(hào)噪音的分析處理可精準(zhǔn)降噪分析每個(gè)過孔顆粒，真正意義上的單顆粒檢測(cè)，可精確分析粒徑分布廣的多分散樣本，具備更寬的粒徑LOD (15-2000 nm) 和極寬的濃度LOD (106-1012 particles/mL)。
參考文獻(xiàn)
[1] Welsh JA, Goberdhan DCI, O'Driscoll L, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches [published correction appears in J Extracell Vesicles. 2024 May;13(5):e12451. doi: 10.1002/jev2.12451]. J Extracell Vesicles. 2024;13(2):e12404.
[2] Li Y, Zhang S, Liu C, et al. Thermophoretic glycan profiling of extracellular vesicles for triple-negative breast cancer management. Nat Commun. 2024;15(1):2292.
[3] Tian Y, Tian D, Peng X, Qiu H. Critical parameters to standardize the size and concentration determination of nanomaterials by nanoparticle tracking analysis. Int J Pharm. 2024;656:124097.
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