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安捷倫 Cary 60 紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定 4°C下微量 DNA 的純度
安捷倫 Cary 60 紫外-可見分光光度計(jì)配 置微光纖 探頭測(cè)定 4 °C 下微量 DNA 的 純度
應(yīng)用摘要 醫(yī)藥/生物技術(shù) |
總結(jié) |
安捷倫 Cary 60 紫外-可見分光光度計(jì)是在儲(chǔ)存環(huán)境（如冰箱）下直接測(cè)定微量生 |
物樣品的理想儀器。本應(yīng)用報(bào)告展示了如何使用 Cary 60 及其微光纖探頭附件測(cè) 定 4 °C 下 的 DNA 純度——結(jié)果表明，使用該儀器能夠大幅節(jié)省時(shí)間和成本，同 時(shí)數(shù)據(jù)精確度和重現(xiàn)性毫無(wú)損 失。 |
• 不再需要比色皿 |
• 直接測(cè)定 4 °C 冰箱中的樣品 • 節(jié)省每次分析的時(shí)間與成本 前言 多年以來(lái)，紫外-可見分光光度計(jì)一直是生物技術(shù)領(lǐng)域中測(cè)定 DNA 純度和濃度的 一項(xiàng)重要工具。該 方法最早由 Warburg 和 Christian 在 1942 年開發(fā) 1，隨后由 Sambrook 等人在 1989 年進(jìn)行了 優(yōu)化，使其可用于實(shí)驗(yàn)室中簡(jiǎn)便、快速的測(cè)定 2。 分光光度法的主要優(yōu)點(diǎn)在于測(cè)定過程： 1) 簡(jiǎn)便； 2) 準(zhǔn)確； 3) 不破壞樣品。這一 方法可以節(jié)省時(shí)間而不損失數(shù)據(jù)質(zhì)量，并且在測(cè)定過程中無(wú)需使用大 體積的樣 品或額外的耗材，從而帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益。 |
在之前的文章中，我們介紹了安捷倫 Cary 50 紫外-可見分 光光度計(jì)配置 Hellma（德國(guó) Hellma GmbH & Co.）的 Traycell 微量比色
池紫外-可見在室溫下準(zhǔn)確、可重現(xiàn)地測(cè) 定微量 DNA 的方法 3。在本研究中，我們采用帶光纖探頭的 Cary 60 紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)
行了方法擴(kuò)展研究，在 4 。C 以及普通實(shí)驗(yàn)室環(huán)境光照條件下測(cè)定了小體積樣品。本方 法使得用戶可以將儀器靠近樣品，而不是像傳
統(tǒng)光譜方法 那樣將樣品放入儀器中，從而能夠在很短的時(shí)間內(nèi)完成分 析。Cary 60 的光學(xué)設(shè)計(jì)使這一優(yōu)勢(shì)得以實(shí)現(xiàn)，它主要憑 借
其的高強(qiáng)度閃爍氙燈以及最新型的電子器件，使系 統(tǒng)能夠有效地監(jiān)控吸光度的微小變化而不受環(huán)境背景光的 任何影響。本文深入
討論了這一方法的主要優(yōu)點(diǎn)。
儀器與材料
部件號(hào) | 說明 |
G6860AA
7910035600 G6866A 6610000800 D-4764（Sigma 化學(xué)公司） | Cary 60 紫外-可見分光光度計(jì)，配備 WinUV 軟件和 HP 電腦（臺(tái)式機(jī)） 微光纖探頭 光纖探頭耦合器 石英比色皿（光程 1 cm；兩只裝） 小牛胸腺 DNA；1 |
方法與結(jié)果
將小牛胸腺 DNA 用純凈水（MilliQ）稀釋得到不同濃度的樣 品，濃度范圍 0–50 µg/ml。
配有光纖耦合器以及微探頭的 Cary 60, 如圖 1 所示。在 Eppendorf 管中加入 150 µL 純凈水（MilliQ），將其讀數(shù)作為 空白。
由于分子生物學(xué)試劑通常保存于冷藏條件下，因此所有樣 品直接從 4 。C 冰箱中取出并進(jìn)行分析。
圖 1. 配有光纖附件的 Cary 60 測(cè)試 4 。C 下 Eppendorf 管中 150 μL DNA 的示意 圖。
開始時(shí)，使用 WinUV 軟件“掃描"模塊在 340 到 240 nm 范 圍進(jìn)行掃描以確認(rèn)最大吸收峰以及所購(gòu)買的按 50:50 稀釋 的 DNA 樣品的可靠性（圖 2）。
波長(zhǎng)(nm) |
圖 2. 對(duì) 4 。C 下兩個(gè)濃度的 150 µL DNA 樣品的掃描表明特征吸收峰出現(xiàn)在 260 nm 處。注意：50 µg/ml DNA 最大吸光度值 1.0Abs，25 µg/ml DNA 最大吸光度 值 0.5Abs，遵守 Beer Lambert 定律（A = εcl）。
為 了 確 認(rèn) DNA 的 純 度 ，使 用 WinUV 軟 件 專 門 的 “RNA/DNA"模塊測(cè)定 260/280 比率，該模塊可自動(dòng)計(jì)算 DNA 樣品的純
度。如圖3 所示，這一模塊使用非常簡(jiǎn)單，可 以在一分鐘內(nèi)完成分析。
圖 3. 簡(jiǎn)便、專用的 Cary WinUV 自動(dòng)計(jì)算 DNA 的純度、可靠性和濃度
最后，繪制濃度曲線以評(píng)估同一實(shí)驗(yàn)室條件下不同濃度 DNA 樣品讀數(shù)的線性和重現(xiàn)性（圖4）。在兩個(gè) DNA 樣品讀 數(shù)間隙使
用 MilliQ 純凈水清洗微探頭。
討論
測(cè)定五個(gè)樣品所用的時(shí)間不到兩分鐘。傳統(tǒng)方法使用微量 比色皿，需要等待樣品加熱至室溫，而且在每?jī)纱螠y(cè)定間 需要清洗微量比色
皿。總之，使用 Cary 60 光纖系統(tǒng)可以顯 著降低大約 80% 的分析時(shí)間，同時(shí)采用光纖技術(shù)不易受到 樣品處理引起的潛在污染。使用微
探頭可以獲得高精度的 數(shù)據(jù)并大大縮短測(cè)定低溫樣品所需的時(shí)間，這表明 Cary 60 是一種適于測(cè)定生物樣品（如 DNA）的簡(jiǎn)便、快速且
高性價(jià) 比的系統(tǒng)。本方法可以輕松地直接擴(kuò)展到其它樣品類型， 例如可在 280 nm 處測(cè)定蛋白質(zhì)。
結(jié)論
Cary 60 紫外-可見分光光度計(jì)是使用光纖采樣的理想儀器， 它的高強(qiáng)度閃爍氙燈可以提供的靈敏度和重現(xiàn)性。 本應(yīng)用報(bào)告所展示的測(cè)
定 DNA 樣品時(shí)的分析速度、結(jié)果重 現(xiàn)性以及易用性證明了該儀器系統(tǒng)的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。
使用帶光纖的 Cary 60 分析生物樣品還具有如下優(yōu)點(diǎn)：
• 可以直接測(cè)定高溫或低溫樣品（4 °C – 110 °C）而無(wú)需 考慮冷凝的問題，如果使用比色皿則由于冷凝可能導(dǎo) 致結(jié)果不正確或重現(xiàn)性不好
• 樣品體積不受限制，可以低至 40 µL，也可以無(wú)限大
• 無(wú)需購(gòu)買昂貴的石英微量比色皿，更節(jié)省了清洗比色 皿的時(shí)間
• 使用反射探頭還可以分析固體、粉末或凝膠類樣品
圖 4. 使用微探頭光纖附件在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)光照條件下測(cè)定 4 °C 下 Eppendorf 管中 50 µL DNA 樣品（0–
50 µg/mL）得到的濃度曲線。校準(zhǔn)方程：Abs = 0.02393*濃 度；相關(guān)系數(shù) = 0.99126。