原位雜交技術(shù)屬于核酸分子雜交的一種，是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞中的待測核酸雜交，再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術(shù)。

原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來。

當(dāng)然雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。

原位雜交的技術(shù)要點(diǎn)主要是：雜交最適溫度、雜交的嚴(yán)格性、保溫時間、雜交促進(jìn)劑。

   一、反應(yīng)溫度  

雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。

若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。

通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。

01

最適復(fù)性溫度（optimum renaturationtemperature，TOR）：Tor=Tm-25℃

02

苛刻復(fù)性溫度：Ts=Tm-（10或15℃）

03

非苛刻復(fù)性溫度：Tns=Tm-（30或35℃）

設(shè)置和調(diào)整雜交溫度是原位雜交的重要環(huán)節(jié)，雜交溫度應(yīng)低于解鏈或融接溫度20～30℃，多數(shù)雜交Tm為95℃，由于這一溫度對保存組織形態(tài)完整和組織切片的黏附將產(chǎn)生不利影響，為此在雜交液中常增加甲酰胺濃度來降低Tm值，因每增加1%甲酰胺濃度可降低0.72℃。

   二、嚴(yán)格性  

雜交的嚴(yán)格性影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性，一般認(rèn)為可通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。

   三、保溫時間  

雜交反應(yīng)時間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20小時左右。

雜交反應(yīng)時間可隨探針濃度的增加而縮短，雜交時間過短會造成雜交不wan全；雜交時間過長會增加非特異性著色，一般都采用雜交孵育過夜的方法，在黑暗環(huán)境下進(jìn)行，可避免光線對甲酰胺的電離作用。

   四、雜交促進(jìn)劑  

惰性多聚體可用來促進(jìn)250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高。

常見的雜交促進(jìn)劑有硫酸葡聚糖、聚丙烯酸、酚、硫氰酸胍。其中硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前常用的雜交促進(jìn)劑。

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