小鼠主動脈平滑肌細胞分離自主動脈組織；主動脈是體循環(huán)的動脈主干。其運行路徑為：升主動脈起于左心室，至右側第2胸肋關節(jié)高度移行為主動脈弓，弓行向左后至第4胸椎體下緣移行為降主動脈；在第12胸椎體高度穿膈的主動脈裂孔移行為腹主動脈，以上為胸主動脈，至第4腰椎體下緣分為左、右髂總動脈；髂總動脈在骶髂關節(jié)高度分為髂內(nèi)、外動脈。主動脈平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細胞貼壁伸展，細胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細胞匯合，多數(shù)細胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏；細胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學特征和生長特點。主動脈平滑肌細胞在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，以主動脈平滑肌細胞為實驗研究對象，探討心血管疾病相關發(fā)病機制是目前研究的熱點；體外培養(yǎng)的主動脈平滑肌細胞對于研究其生理功能、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義。

　　小鼠主動脈平滑肌細胞分離培養(yǎng)方法：

　　1）取材：頸椎脫臼處死小鼠，在75%乙醇中浸泡2min，用眼科剪鑷依次打開胸、腹腔，暴露心臟；10mL注射器抽取無菌PBS約10mL，連接在1mL注射器針頭上穿刺左心室，沖洗主動脈。完整分離主動脈，放入35mm平皿中，加入2mL PBS緩沖液。在體視顯微鏡下小心將血管周圍的結締組織去除，使用顯微彈簧剪沿主動脈縱軸剪開動脈，用顯微鑷子小心分離動脈中膜層并移入另一個含有2mL含20%FBS的DMFM/F12培養(yǎng)液的35mm平皿中，迅速轉移至超凈臺。用眼科剪將中膜剪成大小約1mm×1mm的組織塊，備用。

　　2）組織塊培養(yǎng)法：將組織塊連同培養(yǎng)液一起移入6孔板中，小心吸出培養(yǎng)液，搖晃6孔板，使組織塊分散分布于6孔板底，將細胞移入5%CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育6h，使組織塊牢固貼附于培養(yǎng)孔底部后緩慢加入2mL含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。放入5%CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d換液一次，組織塊周圍爬出的細胞達到培養(yǎng)面積80%時（18~20d）進行傳代。

　　3）膠原酶消化法：將剪碎的組織塊移入到15mL離心管中，加入3mL消化液（7.5mgII型膠原酶溶于5mL含20%FBSDMEM/F12中），放入培養(yǎng)箱中消化6h，1200r/min離心5min，去掉上清，加入2mL含20%FBSDMEM/F12培養(yǎng)基，輕輕吹打分散細胞，接種于6孔板中，置于5%CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當細胞生長至80%匯合度（7~10d）即可傳代。

　　4）細胞的生長及傳代：吸取并棄掉舊培養(yǎng)基，加入PBS磷酸緩沖液清洗細胞充分洗去殘留的血清成分；6孔板每孔加入0.25%胰蛋白酶500μL，在37℃消化3min；倒置顯微鏡下觀察到細胞收縮變圓時，立即加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基終止消化，將細胞從培養(yǎng)板底沖洗下來，以1：3的比例傳代至新的6孔板中。每2d換液1次，待細胞生長達到70%以上匯合度時再次傳代。

　　5）小鼠主動脈平滑肌細胞鑒定：分別對2種方法分離的3代和8代細胞進行免疫熒光鑒定。待細胞處于指數(shù)生長期時，棄培養(yǎng)基，加入PBS緩沖液清洗3次，每孔加入1mL4%多聚甲醛，室溫固定20min；PBS洗3次，加入0.25%TritonX-100室溫透膜1h；PBS洗3次，加入含10%山羊血清PBS的封閉液室溫封閉1h；PBS洗3次，加入羊抗鼠α-SMA一抗（1：200稀釋），4℃孵育過夜；PBS洗5min×3次；加入Alex488兔抗羊二抗（1：1000稀釋）4℃孵育過夜；避光下PBS洗5min×3次；加入DAPI染核，室溫避光10min，PBS洗5min×3次；在倒置熒光顯微鏡下觀察。

　　6）結果：采用組織塊培養(yǎng)法的細胞8d左右可見細胞從組織塊周圍爬出，培養(yǎng)12d左右組織塊周圍細胞明顯增多，細胞中可見1個或數(shù)個核仁，細胞主要為長梭狀、帶狀或三角狀，部分細胞有突起胞核位于細胞中央（圖1A）。培養(yǎng)18d左右細胞達到80%匯合度。采用膠原酶消化法分離的小鼠主動脈小鼠主動脈平滑肌細胞于24h后完全貼壁，胞質(zhì)完全伸展，第4~7d細胞增殖速度加快（圖1B），生長7d后細胞匯合度可達80%以上，細胞致密呈多層典型"峰-谷"結構出現(xiàn)。