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人肺微血管內皮細胞培養實驗方法
人肺微血管內皮細胞分離自肺組織;肺是機體的呼吸器官,位于胸腔,左右各一,覆蓋于心之上。肺有分葉,左二右三,共五葉。肺經肺系(指氣管、支氣管等)與喉、鼻相連,故稱喉為肺之門戶,鼻為肺之外竅。微血管內皮細胞密切參與包括再生、發育、傷口愈合等一系列生理及炎癥反應。細胞呈梭形或多角形,形成單層后呈鵝卵石樣或鋪路石樣排列。肺微血管內皮細胞構成半選擇性屏障,該屏障對于肺氣體交換,調節液體和可溶物在血液與肺間質之間的流動具有重要意義。
人肺微血管內皮細胞培養實驗方法:
1. 將肺組織至于無菌的培養皿中用含雙抗的1×PBS(pH=7.4)清洗若干次至無明顯血細胞;
2. 剪取肺組織邊緣微血管豐富的組織,用含雙抗的1×PBS(pH=7.4)清洗兩次;
3. 將剪取的肺邊緣組織剪成2-3mm3 大小,加入含雙抗的1×PBS(pH=7.4)清洗;
4. 用進行過滅菌處理的玻璃滴管將剪碎的組織塊和清洗用的1×PBS(pH=7.4)一起轉入15ml離心管中;
5. 250rpm/min離心2 min,小心傾去液體,再加入適量的含雙抗的1×PBS(pH=7.4),用玻璃滴管吹吸液體以清洗組織塊;
6. 繼續250rpm/min離心2 min,小心傾去液體,重復上述步驟若干次,直至離心后的液體中觀察不到明顯的紅色;
7. 將清洗好的組織塊重新轉至無菌的培養皿中,用無菌的200 ml的吸頭將組織塊貼于25cm2 培養瓶中;
8. 加入2ml培養基,將培養瓶倒置放于37℃、5%CO2 的培養箱中2-3h之后正置培養瓶繼續培養;
9. 培養若干天后,可觀察到組織塊周圍陸續有細胞爬出,繼續培養幾天,直至組織塊周圍的細胞達到較高密度(培養其間兩天換液一次,換液操作時動作一定要輕柔,以防組織塊被搖下);
10. 當組織塊附近的細胞生長到較高密度后,將貼壁的組織塊吹下,換新的培養基繼續培養24;
11. 24h后,用0.25%的Trypsin-EDTA消化細胞,FBS中止消化,將消化后的細胞懸液轉入15ml離心管,1000rpm/min離心5min,之后傾去廢液,用培養基重懸細胞,轉入原來的培養瓶中,繼續在37℃、5%CO2 的培養箱中培養。
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