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PriCells: 從小鼠脾臟分離小鼠天然殺傷細(xì)胞
PriCells: 從小鼠脾臟分離小鼠天然殺傷細(xì)胞
基本方案：
由于所用Mab只能檢測(cè)C57BL背景小鼠體內(nèi)的NK1.1CD3-NK細(xì)胞，故本方案適用于C57BL/6或者C57BL/10（以及H2b、d、q同系小鼠）小鼠脾臟細(xì)胞。
清楚雜細(xì)胞所用的單克隆抗體的活性對(duì)本方案至關(guān)重要。單克隆抗體可以買到，并且其雜交瘤可以從ATCC得到，因此建議檢測(cè)單克隆抗體的活性以保證實(shí)驗(yàn)成功。最佳補(bǔ)體和細(xì)胞濃度也需要通過實(shí)驗(yàn)確定。
實(shí)驗(yàn)材料：
1. C57BL/6或者C57BL/10小鼠
2. Tris/NH4Cl裂解緩沖液
3. HBSS/3%（V/V）FBS
4. 10×單克隆抗體儲(chǔ)存液
5. GK1.5（ATCC號(hào)TIB207）、53-6.72（TIB105）、M5/114.15.2（TIB120）、J11d.2（TIB183；PharMingen）
6. 單克隆抗體MAR18.5（TIB216；PharMingen）濃度1mg/ml
7. 含酚紅的HBSS（Life Technologies）/10%（V/V）FBS
8. 低Tox-M兔補(bǔ)體，無菌復(fù)溶
9. 淋巴細(xì)胞M密度梯度分離液（Accurate Chemical and Scientific），室溫
10. RPMI-10*培養(yǎng)基
11. FITC標(biāo)記的抗CD3抗體和PE標(biāo)記的PK136抗體（PharMingen）
12. 15ml和50ml帶蓋聚丙烯錐底離心管
13. Beckman CS-6R離心機(jī)（或同類離心機(jī)）
14. 血清學(xué)吸管
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 處死小鼠，無菌取脾臟。
2. 制備脾臟細(xì)胞懸液，置于50ml離心管中，避免將纖維性雜質(zhì)移入離心管。200g離心5min以洗滌細(xì)胞。采用“去除脾臟細(xì)胞懸液中的紅細(xì)胞"的方法裂解紅細(xì)胞，或使用Tris/NH4Cl裂解緩沖液。每個(gè)脾臟的細(xì)胞用1ml HBSS/3%（V/V）FBS混懸。
3. 用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞。用HBSS/3% FBS混懸細(xì)胞至5×107個(gè)細(xì)胞/ml。置于冰上保存。
4. 制備下述單克隆抗體的10×混合溶液（10×每種抗體的飽和濃度）：
GK1.5（抗CD4）
35-6.72（抗CD8）
M5/114.15.2（抗I-A和I-Ed,k）
J11d.2（抗CD24）
5. 每0.9ml細(xì)胞懸液加入0.1ml單克隆抗體混合液，4℃孵育30min。
6. 用冰的HBSS/3% FBS洗細(xì)胞2遍，4℃，200g離心5min，棄上清。用10ml冰的HBSS/3% FBS混懸細(xì)胞再洗一遍。將細(xì)胞用HBSS/10% FBS混懸至濃度5×107個(gè)細(xì)胞/ml。
7. 加入10mg/ml抗大鼠κ（MAR18.5；1mg/ml儲(chǔ)存液）和低Tox-M兔補(bǔ)體至細(xì)胞懸液使其達(dá)到最佳終濃度（通常1：6，但需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定）。37℃孵育45min，每15min振搖一次。
8. 用HBSS/10% FBS洗一遍（步驟6）。
9. 用5ml HBSS/10% FBS混懸細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以確定補(bǔ)體裂解效果。
10. 將5ml室溫的淋巴細(xì)胞M密度梯度分離液加入到一個(gè)15ml離心管中。將5ml細(xì)胞懸液輕輕加在分離液上。室溫，200g離心20min，使離心速度緩慢下降。
11. 用吸管從界面小心吸取液體，放在另一個(gè)15ml離心管中。必要時(shí)可將界面放在白色背景前以便看清。用RPMI-10*培養(yǎng)基洗2遍（方法同步驟6）。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，備用。
12. 為檢驗(yàn)細(xì)胞純度，可加入終濃度為10mg/ml的抗CD3-FITC和PK136-PE（抗NK1.1）抗體，進(jìn)行流式分析。
附錄：
HBSS/10%（V/V）FBS和HBSS/3%（V/V）FBS：
56℃ 45min熱滅活FBS，過濾。取HBSS，加入不同量的FBS，分別配置含10%和3%（V/V）FBS的HBSS溶液。在10%FBS的HBSS溶液中加入酚紅，而3%FBS的溶液不加酚紅，以示區(qū)分。4℃可保存6個(gè)月。
大鼠補(bǔ)體，低Tox-M，無菌復(fù)溶：
將凍干的低Tox-M大鼠補(bǔ)體（Accurate Chemical and Scientific）用無菌的HPLC級(jí)的純水溶解，臨用前配置。如需要，可以用0.45mm濾膜過濾除菌。滴定法測(cè)定每批次產(chǎn)品的細(xì)胞毒活性。記住始終置于冰上操作。凍存時(shí)迅速置入-70℃冰箱中，于-70℃可保存6個(gè)月。
Tris/NH4Cl裂解緩沖液：
90ml 0.16mol/L（8.3g/L）NH4Cl
10ml 0.17mol/L Tris·Cl，pH7.65
用HCl調(diào)pH至7.2
過濾除菌
室溫可保存3個(gè)月