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你知道如何正確計算顯微鏡的分辨率嗎?

閱讀:4847        發(fā)布時間:2023-4-18

在計算分辨率的理論J限的時候需要考慮很多因素。分辨率還取決于樣本性質。我們來看一下使用阿貝衍射J限以及使用瑞利判據(jù)進行的分辨率計算。

 

先應當要牢記:

 

NA= n x sin α

 

式中n為成像介質的折射率,α是物鏡孔徑角的一半。物鏡的Z大孔徑角大約為144o。該角度一半的正弦為0.95。如果使用油浸物鏡且折射率為1.52,則物鏡的Z大NA為1.45。如果使用‘干式’(無浸沒)物鏡,則物鏡Z大NA為0.95(因為空氣的折射率為1.0)。

 

橫向(即XY)分辨率的阿貝衍射公式為:

 

d= λ/2 NA

 

式中λ 是標本成像所用的光波長。如果使用514 nm的綠光及NA為1.45的油浸物鏡,則分辨率的(理論)J限將達到177 nm。

 

軸向(即Z)分辨率的阿貝衍射公式為:

 

d= 2 λ/NA2

 

同樣的,如果我們假設通過波長514 nm的光來觀察標本且物鏡NA數(shù)值為1.45,則軸向分辨率為488 nm。

 

在阿貝衍射J限的基礎上,瑞利判據(jù)稍稍得到了細化:

 

R= 1.22 λ/NAobj+NAcond

 

式中λ為標本成像用的光波長。NAobj 為物鏡NA。NAcond為聚光鏡NA?!?.22’是一個常系數(shù)。該數(shù)值根據(jù)Rayleigh的貝塞爾函數(shù)研究推導得出。這些主要用于對系統(tǒng)當中的問題,例如波的傳遞,進行計算。

 

將聚光鏡的NA考慮在內,空氣(折射率為1.0)通常是聚光鏡和玻片之前的成像介質。假設聚光鏡的孔徑角為144o,則NAcond數(shù)值將等于0.95。

 

如果使用514 nm的綠光,油浸物鏡的NA為1.45,聚光鏡的NA為0.95,則分辨率的(理論)J限將達到261 nm。

 

如上所述,用于對標本成像的光波長越短,可以分辨的細節(jié)越多。因此如果使用400 nm的Z短可見光波長,油浸物鏡NA為1.45,聚光鏡NA為0.95,則R等于203 nm。

 

要在顯微鏡系統(tǒng)當中達到(理論)分辨率的Z大值,每個光學組件都應當具備Z高可用的NA(把孔徑角納入考慮)。此外,觀察標本所用的光波長越短則分辨率越高。Z后,整個顯微鏡系統(tǒng)都應當準直對齊。

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