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熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡區(qū)別及特性

閱讀:4280        發(fā)布時間:2022-6-24

熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同,它不是通過普通光源的照明觀察標(biāo)本,而是利用定波長的光(通常是紫外光、藍(lán)紫光)激發(fā)顯微鏡下標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì),使之發(fā)射熒光,所以,熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明,而是作為種激發(fā)標(biāo)本的內(nèi)熒光物質(zhì)的能源。我們之所以能觀察標(biāo)本,不是由于光源的照明,而是標(biāo)本內(nèi)熒光物質(zhì)吸收激發(fā)的光能后所呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。由此可知,熒光顯微鏡的特點,主要是它的光源能供給大量特定波長范圍的激發(fā)光,使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)能獲得必要強(qiáng)度的激發(fā)光。同時,熒光顯微鏡必須具備相應(yīng)的濾光鏡系統(tǒng)。熒光顯微鏡是**熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成,是利用定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。


熒光顯微鏡.png



1.激發(fā)熒光的方式:按光的波長范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見的激發(fā)光,所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光,容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。

 

2.BV激發(fā)法:是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本,所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可*阻斷藍(lán)光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對于激發(fā)光的大吸收波長和熒光的大發(fā)光波長比較接近,所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光,所以熒光色素的吸收效率較,可得到較明亮的圖像。其缺點是500nm以下的熒光無法看到,而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中,大多以熒光色素*的顏色來判斷其特異性,所以在討論微妙的特異性時,上述BV激發(fā)法的缺點往往影響大。

 

 熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡光源的區(qū)別

 熒光顯微鏡的光源主要采用氙弧燈或汞燈,但近年來也使用高功率LED作光源,而普通光學(xué)顯微鏡通常只有鹵素或LED燈來照明。熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式,也就是說光源是通過物鏡來投放于試驗樣本上,而普通光學(xué)顯微鏡是直接用光源照射樣品,從而進(jìn)行的觀察。在分辨率上講,熒光顯微鏡利用的是紫外線光源,波長比較短,但是分辨率卻高于普通的光學(xué)顯微鏡。在濾光片的使用上,熒光顯微鏡是用了兩個特殊的濾光片,在光源前的作用是用來濾出可見光,在物鏡和目鏡之間的作用是用來濾出紫外線,以保護(hù)觀察者的眼睛。熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別大致就是這些。

 

熒光顯微鏡工作原理

多采用200W的超高壓汞燈作光源,它是用石英玻璃制作,中間呈球形,內(nèi)充一定數(shù)量的汞,工作時由兩個電極間放電,引起水銀蒸發(fā),球內(nèi)氣壓迅速升高,當(dāng)水銀*蒸發(fā)時,可達(dá)5070個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力,這一過程一般約需515min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光,足以激發(fā)各類熒光物質(zhì),因此,為熒光顯微鏡普遍采用。

1.激發(fā)濾板根據(jù)光源和熒光色素的特點,可選用以下三類激發(fā)濾板,提供一定波長范圍的激發(fā)光。

 紫外光激發(fā)濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過,阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1UG-5,外加一塊BG-38,以除去紅色尾波。

紫外藍(lán)光激發(fā)濾板:此濾板可使300450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2ZB-3,外加BG-38

紫藍(lán)光激發(fā)濾板:它可使350490nm的光通過。常用型號為QB24BG12)。

 最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達(dá)明色素)可用藍(lán)綠濾板(如B-7)激發(fā)。


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