inspiralis ——————超螺旋檢測

時間：2024/5/30閱讀：771

DNA 旋轉(zhuǎn)酶是一種不一樣的拓?fù)洚悩?gòu)酶，因?yàn)樗悄軌虼呋?DNA 負(fù)超螺旋的酶。該過程依賴于 ATP，通過雙鏈 DNA 的切割和重新連接以 2 步進(jìn)行。

有關(guān)該反應(yīng)的概述，請參閱：McKie , SJ 、 Neuman, KC和 Maxwell, A. ( 2021 )。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶：通過結(jié)構(gòu)功能分析進(jìn)一步了解細(xì)胞作用和多蛋白復(fù)合物。BioEssays ， 43 ，e2000286。

典型反應(yīng)如下：

將 1 U DNA 促旋酶與 0.5 µg 松弛 pBR322 DNA 在 30 µl 反應(yīng)體系中在 1X 檢測緩沖液中于 37°C 下孵育 30 分鐘

通過添加 30 µl 氯仿/異戊醇 (24/1) 和 30 µl 終止緩沖液 (STEB：40% 蔗糖、100 mM Tris.HCl (pH 7.5)、100 mM EDTA、0.5 mg/ml 溴酚藍(lán)) 來終止每個反應(yīng)，然后將其加載到瓊脂糖凝膠上。(0.8%-1.0%：w/v)

凝膠可以在 TBE（90 mM Tris.Borate、2 mM EDTA）或 TAE（40 mM Tris.Acetate、2 mM EDTA）中運(yùn)行，但如果在 TAE 中以最高 90V 運(yùn)行 2 - 3 小時，超螺旋 pBR322 的分辨率會好得多。

典型凝膠：

大腸桿菌促旋酶超螺旋

所用的 DNA 底物（本例中為松弛的 pBR322）通常由瓊脂糖凝膠上的一系列條帶組成。這些條帶是拓?fù)洚悩?gòu)體（具有不同連接數(shù)的 DNA）。

用 DNA 促旋酶處理松弛的 pBR322 可將松弛的拓?fù)洚悩?gòu)體轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒的超螺旋形式，后者在瓊脂糖凝膠上遷移速度更快。還可以看到上部條帶，這是開環(huán)（有缺口）DNA，它存在于松弛的基質(zhì)中，但與一些松弛的拓?fù)洚悩?gòu)體一起遷移。

嵌入劑

如果凝膠槽中存在溴化乙錠或氯喹等污染物，則檢測可能會出現(xiàn)問題。這些化學(xué)物質(zhì)是嵌入劑，會影響 DNA 的移動性，導(dǎo)致結(jié)果混亂。如果緩沖液中存在嵌入劑，則松弛的拓?fù)洚悩?gòu)體會提高移動性，并大致在與負(fù)超螺旋質(zhì)粒相同的位置運(yùn)行。根據(jù)嵌入劑的量，負(fù)超螺旋 DNA 的移動性可能略低于正常水平。

核酸酶

如果檢測中存在污染性核酸酶（由于檢測緩沖液被污染或細(xì)胞表達(dá)的不純級分），切口可能會顯著增加，從而導(dǎo)致開環(huán) DNA 的數(shù)量增加，并可能產(chǎn)生線性 DNA。這在 OC 和 SC 之間以單一帶的形式運(yùn)行。

ATP

之前活性酶的活性喪失可能是由于緩沖液中 ATP 的劣化所致，盡管 5X 檢測緩沖液已被開發(fā)以盡量減少這種情況。如果發(fā)生活性喪失，則在反應(yīng)中添加額外的 ATP 將克服該問題。

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