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陽離子脂質體的制備及細胞轉染

時間:2023/10/25閱讀:982
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設備及材料

  • 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺

  • 陽離子脂質

  • 氯仿

  • 蒸餾水

  • 緩沖

  • 帶聚四氟乙烯內襯的玻璃瓶

  • 玻璃注射器

  • 氮氣或氬氣

  • 真空系統

  • 0.22μm 過濾器(可選)

程序

  1. 將每種脂質成分(例如,DOTAP/DOPE)溶解在氯仿中至方便的工作濃度(1-10mg/mL)。

  2. 使用玻璃注射器將所需量的每種成分等分到玻璃瓶中。有關處理脂質有機溶液的更多信息。

  3. 全部混合玻璃瓶中的成分。

  4. 使用氮氣或氬氣流小心地蒸發氯仿(在充分通風的情況下)。

  5. 將脂質殘留物放在真空泵上 10-15 分鐘,以除去任何殘留的有機溶劑。

  6. 從真空泵中取出小瓶,并立即以最終脂質濃度的兩倍懸浮在蒸餾水中。

  7. 將脂質分散體超聲處理至澄清(2-5 分鐘)。

  8. 添加等體積的緩沖液(例如,308mM NaCl、40mM Hepes、pH7.4),并進一步超聲處理 2 分鐘。

  9. 溶液可通過 0.22μm 過濾器進行滅菌。

脂質/DNA 混合物的制備

  1. 將陽離子脂質分散體與 DNA(每 10μg 脂質 1μg)混合在合適的容器中。

  2. 將脂質/DNA 混合物孵育 5 分鐘。在室溫下。

  3. 5 分鐘后,混合物即可用于轉染細胞。

細胞轉染

  1. 用 HEPES 緩沖鹽水洗滌細胞單層兩次。

  2. 將細胞與脂質/DNA 混合物在 HEPES 緩沖鹽水(每 100 mm 培養皿 3 ml 混合物)中于 37°C 孵育 90 分鐘。

  3. 孵育期結束后,根據需要更換培養基或補充。

  4. 將細胞培養所需的時間并收獲。

筆記

  • DOPE:陽離子脂質的常見摩爾比為3:1和1:1。在某些情況下,全部由陽離子脂質組成的脂質系統已被用于轉染細胞。

  • 所引用的緩沖系統旨在用于體外使用,并不表明該系統可能適合體內使用。

參考

  • Leventis, R. 和 Silvius, JR (1990)。生物化學。生物物理學。Acta 1023:124-132。



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