丙酮酸羧化酶是細胞質和線粒體代謝途徑的重要元素，可以有效促進能量代謝。在 CHO 細胞中過表達酵母胞質丙酮酸羧化酶 (PYC2)，可 以增加丙酮酸流向 TCA 循環。增強的 PYC2 表達導致丙酮酸通量增加，從而使乳酸積累減少多達 4 倍，并顯著增加細胞密度和培養壽命。有了這個結果，與親本細胞相比，工程細胞的抗體表達顯著提高了 70%，產品質量也有所提高（約 3 倍）。通過 PYC2 工程 改造提升細胞性能，在丙酮酸、葡萄糖、乳酸和細胞能量代謝方面具有均高于親代細胞的各種優勢。
PYC2 工程改造原理和方法
在補料分批上游工藝中，產生抗體的 CHO 細胞需要持續提供碳、氮、能量 (ATP) 和還原劑 (NADPH) 以維持其合成代謝功能。 由于培養基消耗糖酵解過程會產生乳酸和氨等不需要的廢物，這些物質積累，會阻礙細胞生長以及重組產品的產品質量屬性。
糖酵解是葡萄糖被氧化的主要分解代謝途徑，最后，一分子葡萄糖轉化為兩分子丙酮酸，然后進入線粒體并在 TCA 循環中被氧化。CHO 細胞在補料分批模式下的細胞代謝需要高速率的糖酵解，從而觸發丙酮酸的積累。由于線粒體和胞質代謝系統的連通性差，大部分積累的丙酮酸通量驅動乳酸脫氫酶 (LDH) 產生乳酸. 乳酸的測定一般使用EKF Biosen C-Line 來進行葡萄糖乳酸分析。
迄今為止，已經嘗試了多種方法來使用生產宿主的代謝工程或細胞培養過程的過程工程來減少細胞培養廢物。比如使用半乳糖或丙酮酸替代葡萄糖，或用天冬酰胺或谷氨酸替代谷氨酰胺。調節細胞系統代謝途徑中涉及的酶來減少廢物積累也是一種不錯的選擇。
PYC2 工程改造是通過在哺乳動物細胞 BHK 和 HEK293 細胞中表達胞質酵母丙酮酸羧化酶 2 (PYC2) 基因來減少乳酸積累，從而增加蛋白質產量或改善細胞生長， 實驗證明，在 CHO 細胞中過表達 PYC2 可以延長細胞培養時間，并將乳酸/葡萄糖比率降低 25%，但是，比生產率降低 50%，從而影響整體體積抗體表達。主要方法是通過 PYC2 改造的細胞庫的異源群體中篩選 PYC2 改造的 CHO 克隆。隨后，根據培養性能及其代謝特征從 PYC2 克隆組中選擇單細胞克隆?；诟鞣N生化和代謝分析，建立了一個代謝控制的 CHO 平臺，該平臺具有增強的 PYC2 基因負載，并且能夠在較高的細胞密度、高葡萄糖消耗率和降低的乳酸的分批補料過程中維持較長時間積累。
PYC2 工程的細胞庫生成和細胞系開發
   為了增強細胞代謝并改善細胞溶質和線粒體代謝途徑，我們通過增加 CHO 細胞池中的 PYC2 基因負荷來改造 CHO 細胞系統。在這項研究中，我們使用密碼子優化（針對 CHO）酵母丙酮酸羧化酶 (PYC2) 基因，該基因在 CHO 細胞的胞質溶膠中表達。PYC2 通過將細胞溶質丙酮酸驅向代謝途徑的克雷伯循環，在控制丙酮酸積累方面發揮關鍵作用"。增加表達代謝優化 PYC2 基因的基因拷貝可有效觸發丙酮酸流向線粒體代謝途徑，并將糖酵解與 TCA 循環聯系起來，以增強內部細胞能量代謝。 
    通過使用氖電穿孔法，用帶有 PYC2 基因的質粒 pMPYC 轉染 CHO-S 細胞（懸浮液），并產生穩定的細胞庫。為了從轉染池中篩選出所需的 CHO 克隆，我們應用了兩階段選擇方案，其中我們使用不同濃度的選擇劑嘌呤霉素和 MTX 生成了轉染的 CHO 細胞群. 選擇壓力從低濃度逐漸增加到高濃度，通過消除源自高度異質性群體的不良細胞/克隆，可以嚴格選擇所需的細胞庫。選定的池具有混合的轉染 PYC2-CHO 細胞群，這些細胞含有不同的 PYC2 基因拷貝，并且還由于隨機整合事件以及 CHO 基因組中的位置效應而改變 PYC2 表達模式。為了評估每個池的代謝性能，我們進一步選擇了池 1B、1C 和 2D 來評估 PYC2 表達效率，隨后使用 CD-Forti-CHO 基礎培養基和nest搖瓶進行了補料分批培養實驗。實驗中評估了代謝特征（乳酸和葡萄糖），細胞活力和生長模式從細胞周期的指數期到穩定期，并將幾個重要參數與親代 CHO 細胞（未轉染）進行了比較。

實驗結論
    通過觀察，pool 1B（選自 Phase I，含有 200nM MTX 和 20ug/ml Puromycin），pool 1C（選自 phase II，含有 500nM MTX 和 30ug/ml Puromycin）和 pool 2D（選自 phase II，含有1000nM MTX 和 50ug/ml Puromycin）在細胞活力和細胞密度分布方面顯示出它們之間以及與親代 CHO 細胞的顯著差異。在池 1B 中，達到的峰值細胞密度高達 2000 萬個細胞/mL，但是，細胞活力從第 10 天開始下降，并在第 14 天達到約 72%，而池 1C 顯示細胞密度高達 2300 萬個細胞/mL，并且活力從第 11 天開始下降，并在同一天（第 14 天）達到約 83%。相比之下，從最高濃度的選擇劑中選出的 2D 池顯示出顯著延長的細胞活力以及池中最高的細胞密度（圖 1B 和 1C）。在池 2D 中，達到的峰值細胞密度約為 2600 萬個細胞/mL，第 14 天的細胞活力約為 92%，比包括親代 CHO 細胞在內的其他兩個池（圖 1B 和 1C）高10-20 %，如上所述. 此外，我們分析了細胞在乳酸積累和消耗率方面的代謝行為，發現與其余池和親代細胞相比，2D 池在乳酸代謝方面存在顯著差異。池 2D 和 1C 以及池 1B 和親代 CHO 細胞的乳酸譜彼此相似，但是，池 2D 的乳酸產量顯著降低（圖 1D）與其他細胞池相比。由于這些池具有不同 PYC2 基因負載的異質細胞群，并且在補料分批培養期間，異質群的累積效應顯示細胞活力、密度和乳酸譜的變化，因此我們選擇 2D 池作為后續池的最終池單細胞克隆、篩選和建立潛在的工程細胞候選者。單細胞分選是使用 Guava® Muse-細胞分析儀通過為活的和良好的邊緣/邊緣細胞形狀設置有效門控來進行的（圖 1E）。細胞分選在白色背景下進行，不使用任何標記試劑/抗體。分選的單細胞最初在 384 孔板中生長，并通過使用 ZenCELL  innoME 活細胞動態成像分析儀在從第 0 天到第 17 天的不同時間間隔進一步監測它們的生長模式（圖1F）。根據細胞/克隆的形態、生長和克隆性，我們挑出那些僅來源于單個細胞的菌落（通過細胞成像儀確認），然后將選定的菌落轉移并從低體積逐漸擴大到高體積按照材料和方法（ 圖 1E 和 1F）中的描述，進入多孔板，然后進入 T-25 燒瓶 . PYC2 克隆 #12 的克隆穩定性研究還在補充有 6mM 谷氨酰胺（搖瓶）的基礎培養基 CD-Forti-CHO 中進行了 70 代，有和沒有選擇壓力，發現穩定性長達 50 代。
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