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蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第6年

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細(xì)胞外泌體來源和外泌體的表征方法

時(shí)間:2023/1/10閱讀:1961
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細(xì)胞外泌體來源及表征方法
細(xì)胞外泌體是直徑為 30-150 nm 的血管外囊泡亞群。在過去的20年里,科學(xué)家已經(jīng)從包括正常細(xì)胞和癌細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞類型中分離出外泌體,并且研究了它們對(duì)其他細(xì)胞的影響。外泌體是由多種大分子組成,例如核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。

細(xì)胞外泌體具有天然的特定細(xì)胞靶向特性,通常被設(shè)計(jì)用于靶向大分子(DNA 和 RNA)和藥物遞送系統(tǒng)(多柔比星、紫杉醇和紫杉醇)。目前常用細(xì)胞外泌體的分離方法主要是超速離心法、密度梯度離心法、超濾分離法、基于聚合物的沉淀法、親和沉淀分離法、  免疫磁珠法和色譜法等

一、外泌體來源及其釋放途徑
外泌體在人體的主要作用是充當(dāng)局部和全身信號(hào)和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。外泌體(直徑 30-150 nm)是較小的血管外囊泡亞群,它的還包括微泡(50 nm-1 μ m)和凋亡小體( 50 nm-5 μm)。

外泌體的來源是內(nèi)體系統(tǒng)。由內(nèi)膜出芽形成早期核內(nèi)體,早期內(nèi)體可以與內(nèi)吞小泡融合,從而引導(dǎo)它們的貨物進(jìn)行回收、降解或分泌。當(dāng)早期內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體時(shí),在它們成熟為晚期核內(nèi)體的過程中,囊泡膜向內(nèi)出芽,導(dǎo)致多泡體 (MVB) 的產(chǎn)生,其中包含許多腔內(nèi)囊泡 (ILV).  在此階段,MVB 可以與溶酶體融合(ILV 繼續(xù)降解)或與質(zhì)膜融合,導(dǎo)致 ILV  釋放到細(xì)胞外空間。這些釋放的 ILV 稱為外泌體,包含著許多源自細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和多糖 。 另一種釋放機(jī)制就是由于質(zhì)膜向外出芽,從而導(dǎo)致形成所謂的脫落微泡或外泌體 。
 
圖 1. 外泌體形成、釋放和細(xì)胞內(nèi)化的方案

二、 外泌體的表征方法
根據(jù)藥物遞送系統(tǒng) (DDS) 表征外泌體結(jié)構(gòu)至關(guān)重要,因?yàn)樗鼪Q定了 DDS 的特性,例如細(xì)胞或組織親和力、應(yīng)激反應(yīng)、吸收途徑和藥物釋放。 2014  年和 2018 年國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì) (MISEV2018) 提出了外泌體(包括研究和外泌體制備)應(yīng)滿足的基本要求指南。在開發(fā)基于外泌體的  DDS 時(shí),必須考慮數(shù)量、大小、形態(tài)、膜組成和蛋白質(zhì)(包括受體)等參數(shù)。這些參數(shù)表征所用的技術(shù)主要為光學(xué)、非光學(xué)和微流體技術(shù)。

1.光學(xué)方法
目前,光學(xué)方法是外泌體表征的主要方法,即動(dòng)態(tài)光散射 (DLS)、多角度光散射 (MALS) 和納米粒子跟蹤分析 (NTA)  。這些方法允許對(duì)尺寸(DLS 0.5–200 nm;MALS 10 –500 nm;NTA 10–1000 nm )、尺寸分布和濃度進(jìn)行高分辨率測(cè)量。 DLS 和 MALS 的結(jié)合增加了測(cè)量范圍 (0.5–500 nm)  和精度。光學(xué)方法比較受歡迎的,但缺點(diǎn)是靈敏度低、試劑消耗高以及需要昂貴的設(shè)備。
在使用 納米粒子跟蹤分析NTA 方法過程中,熒光染料的加入也提高了分辨率,并允許通過使用熒光標(biāo)記來表征表面免疫表型。從而確定標(biāo)記物存在。

2.非光學(xué)方法
非光學(xué)方法主要包括掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)、冷凍電子顯微鏡(Cryo-EM  )、原子力顯微鏡(AFM)、免疫檢測(cè)方法(ELISA)、傅立葉變換紅外光譜(FTIR  )、可調(diào)諧電阻脈沖傳感 (TRPS) 和單粒子干涉反射成像傳感器 (SP-  IRIS ) 。 SEM、TEM 和 AFM 方法通常用于直接膜結(jié)構(gòu)和形態(tài)測(cè)定,而  ELISA 檢測(cè)提供各種結(jié)構(gòu)顆粒(主要是蛋白質(zhì)和受體)的檢測(cè)和量化,例如,用于外泌體形態(tài)的 確認(rèn)。
   
FTIR 光譜和衰減全反射 FTIR (ATR-FTIR) 常用于外泌體質(zhì)量量化和脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量的總體估計(jì)。使用 TRPS  ,可以同時(shí)測(cè)量大小、濃度和 zeta 電位。由于掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡的成本較高,近些年來,一種新型的納米粒度分析儀器在外泌體研究領(lǐng)域迅速發(fā)展,比如 Nanocoulter粒度分析儀可以不僅可以進(jìn)行 單顆粒檢測(cè),顆粒粒徑檢測(cè)還可以檢測(cè)細(xì)胞外泌體的濃度、zeta電位、形態(tài)等進(jìn)行多維度檢測(cè)。

單粒子干涉反射成像傳感器 (SP-IRIS) 也用于外泌體定量,但也可用于檢測(cè)特定標(biāo)記物和確定外泌體亞群. 

3.微流體分析技術(shù)
微流體技術(shù)在外泌體研究方面也起著推動(dòng)作用。微流體技術(shù)不僅提供了高質(zhì)量、高特異性的數(shù)據(jù),并且試劑消耗量低,通量高. 

基于微流體技術(shù)的研究方法需要結(jié)合使用微流控芯片,微流控芯片通常由玻璃基和聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 膜制成,包含許多尺寸適合所分析樣品的微通道。主要區(qū)別在于芯片的內(nèi)表面,可以通過多種方式對(duì)其進(jìn)行功能化,例如通過涂層、多層沉積、電沉積和  蝕刻. 目前研究中針對(duì)不同的微流控表征方法,也制造了不同類型的微芯片,包括免疫芯片、磁性芯片和電化學(xué)芯片。

外泌體及其蛋白質(zhì)也可以通過比色法(標(biāo)記抗體/ELISA)、直接熒光染色( DiO 染料)  、電化學(xué) 性質(zhì)變化和光學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于結(jié)果評(píng)估,還需要額外的設(shè)備,例如讀板器或熒光顯微鏡等.

蘇州阿爾法生物14年專注于生物實(shí)驗(yàn)室儀器和生物試劑 、實(shí)驗(yàn)室耗材的專業(yè)供應(yīng)商。提供的粒度分析儀、熒光顯微鏡等廣泛應(yīng)用于細(xì)胞外泌體的研究。另外,提供的質(zhì)粒提取試劑盒、PCR 試劑、一抗、雙抗、二抗、抗體蛋白、單克隆抗體、基因組提取試劑盒、RNA提取試劑盒、Qpcr試劑、培養(yǎng)基、胎牛血清等生物試劑也廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)。

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