在 HPLC 中，流動相是純溶劑或混合溶劑以及帶有固體改性劑的溶劑。色譜工作者可以針對 HPLC 的不同應用在數百種溶劑中進行選擇。特定的選擇通常受溶劑特性的影響，例如粘度、折射率、非腐蝕性、毒性、混溶性、透明度等。以合理的價格以足夠的純度商業供應也是重要因素。流動相中的溶劑強度或有機溶劑百分比控制分析物的保留時間。
流動相是使分析物通過色譜柱的溶劑。分析物存在于適當的溶劑中，在樣品制備后注入色譜系統。該溶劑不被視為新基質，因為它不會干擾分析?？梢栽跇悠分苽溥^程中選擇分析物的載體（溶劑）的性質，以滿足特定要求，例如揮發性和與 HPLC 中流動相的混溶性。在反相色譜柱中，流動相比固定相更具極性。一般來說是選擇極性流動相，因為分離表現出更好的重現性。
分析物在流動相中的溶解度在色譜柱選擇中也起著重要作用。對于溶于水或部分水性溶劑的化合物，選擇反相 HPLC 不是問題，但對于不溶于極性溶劑的化合物，通常需要使用正相色譜柱。樣品極性、固定相極性和流動相極性的評估對于色譜柱的選擇也很重要。
1.純度：所有溶劑都應具有最高的純度和質量。HPLC 級溶劑經過預過濾和純化，在紫外線下具有最小的吸光度。因此，它們不含會在色譜圖基線中產生假峰的雜質。緩沖液制備中使用的水具有最高純度。去離子水通常含有痕量有機化合物，因此不推薦用于HPLC。
2.粘度：為了保持可接受的壓降 (< 2500 psi) 和合理的流過HPLC色譜柱的流速，流動相粘度應盡可能低。較低粘度的流動相產生較窄的色譜峰。例如乙腈通常是反相 HPLC 的溶劑，因為它不僅粘度低于甲醇或異丙醇，而且具有良好的保留特性。
3.沸點：如果涉及樣品回收，沸點很重要，低沸點溶劑更容易從樣品中去除。
4.無腐蝕性：溶劑必須對 HPLC 系統組件無腐蝕性。
5.毒性：現在每個人都關心與實驗室化學品相關的健康和安全風險。四氫呋喃可用作不穩定或穩定的流動相。不穩定的版本如果蒸發可能有爆炸危險，并且在不儲存在氮氣下時容易分解。穩定版本在用于檢測的典型紫外線波長下具有高紫外線吸收率。
6.混溶性：并非所有HPLC溶劑都可混溶。如果混合了不混溶的溶劑可能會導致一些問題，例如不穩定的基線、波動的壓力、高壓等。異丙醇可與大多數常見的 HPLC 溶劑混溶。因此，在不確定最后使用的溶劑系統的情況下，它可以用來沖洗 HPLC 的流路。
透明度（UV 截止）：流動相（無樣品）必須在用于檢測的波長下充分傳輸。一項研究表明，流動相吸光度在檢測波長處通常應小于0.5。
預混：流動相預混合是通過分別測量每種溶劑的體積并將它們合并到溶劑容器中來完成的。當有機溶劑與水混合時，會出現負混合體積。例如，準備1升的甲醇/水 (50:50)，在量筒中分別量取 500 毫升的甲醇和水，然后將它們混合在一起。由于溶劑在混合時會收縮，因此不宜將500毫升甲醇倒入1升容量瓶中并用水定容，因為需要超過 500 毫升的水。
緩沖：含有酸性或堿性分析物的樣品需要在流動相中加入緩沖液。pH 調節應單獨在水性緩沖液中進行，即在將其與任何有機溶劑混合之前進行。應采取預防措施以防止緩沖沉淀的任何可能性。甲醇可與大多數緩沖液混溶。當磷酸鹽緩沖液與乙腈 混合時，上限應為60-80% ACN，磷酸鹽緩沖液的濃度應小于 15mM 以防止沉淀。2.5至3的酸性pH值是大多數制藥應用的良好起點。這是由于大多數酸性分析物的電離受到抑制以及堿性分析物與硅膠基色譜柱上表面硅醇的相互作用最小。用于流動相制備的常見酸有磷酸、甲酸和乙酸。在整個梯度運行過程中，緩沖添加劑的濃度必須保持恒定。通常建議在流動相的水相和有機相中使用相同濃度的 TFA 或其他酸（吸收紫外線）以抑制梯度運行期間任何類型的基線偏移。
另外，選擇合適的流動相吸濾頭（又稱溶劑進樣口過濾器)可有效濾除流動相中的固體顆粒雜質，但未經過濾的溶劑或溶劑瓶中生長的微生物都會降低溶劑入口過濾頭的壽命和泵的性能，因此，需要定期清洗或更換溶劑進樣口過濾器。
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