許多用戶對溶劑梯度洗脫分離后 LC 色譜柱應該重新平衡多長時間有疑問。在這里，我們展示了對于反相和 HILIC 分離而言，再平衡周期短的令人滿意的結果。
LC 用戶通常會提出和討論關于在溶劑梯度洗脫分離后重新平衡 LC 色譜柱多長時間的問題。在本文中，我們根據最近對該主題的研究討論了細節，并表明即使對于 HILIC 分離，在兩個柱體積數量級的短再平衡周期內也可以獲得令人滿意的結果。
一、核心概念
在溶劑梯度洗脫模式下使用 LC 時，必須有一段時間，通常是在分析結束時，在溶劑梯度的第一部分中使用的流動相流過 LC 色譜柱，為色譜柱做準備。接下來分析。這段時間通常稱為再平衡時間。由于沖洗位于泵系統出口和色譜柱入口之間的儀器組件（例如，混合器、連接管和進樣器環路），會產生一種指數曲線。認識到這種指數沖洗的發生對于理解溶劑梯度洗脫背景下的色譜柱重新平衡至關重要。這是系統的物理行為問題，組成為 φ i的流動相直到梯度程序結束很久之后才開始再次流過色譜柱。
二、色譜柱“重新平衡”意味著什么？
*重新平衡是指色譜柱的一種狀態，即增加重新平衡時間 ( t re-eq ) 不會進一步影響在后續梯度洗脫分離中分離的分析物的保留時間。換句話說，我們可以將這種狀態視為色譜柱與梯度中使用的初始流動相 (φ i ) 真正平衡的狀態。
一些色譜柱的平衡時間也受到鍵合相影響，氰基鍵合相對極性化合物具有*的選擇性，比裸硅膠更適合正相梯度分離。氰基官能團是一種強偶極子，可以與其他偶極子相互作用或在溶質上誘導偶極子。由于烷基接頭，這些相還表現出適度的疏水性。
由于CN鍵合相的快速平衡時間，它是正相模式梯度洗脫的不錯之選。CN 相可用作 Si 相的極性較小的替代品。恒譜生USHA CN氰基柱適合分析雙鍵化合物、循環抗抑郁藥等。
部分、可重復的再平衡：該術語是指色譜柱未與初始流動相*平衡的狀態；然而，只要梯度洗脫分離之間使用的重新平衡時間高度精確，就可以獲得高度可重復的分離。
這兩種平衡狀態之間的區別很重要，因為 1) 達到*重新平衡狀態可能需要很長時間（在某些情況下是幾個小時）；2) 在許多情況下，不需要*重新平衡液相色譜柱即可獲得有用的分析結果。在這些情況下，分離的高度可重復性（例如，通過保留時間的精度來衡量）通常比色譜柱*重新平衡更為重要，如果分析時間可以通過使用不是不必要的長的重新平衡時間來減少，那么這可以顯著提高通量并降低分析成本。
三、結論
我們從詳細研究反相色譜柱的再平衡中學到了一些東西：如果我們總結在第一次深入研究溶劑梯度洗脫后反相色譜柱重新平衡這一主題期間所做的大量工作，我們最終得出兩個主要結論：在達到tflush后，使用梯度中使用的初始流動相，只需一或兩根平衡柱就可以獲得高度可重復的梯度洗脫分離。
*平衡的進展可能會受到多種因素的影響，例如緩沖液濃度和 pH 值，尤其是對于離子分析物。
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