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co-ip檢測科研實驗技術服務介紹

閱讀:288          發布時間:2024-9-24
co-ip檢測


應用簡介
       Co-IP主要用于檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用,是IP實驗的一種擴展,基于IP反應的潛力,在樣品溶液中捕獲和純化主要目標(抗原等)及通過天然相互作用與靶標結合的其他的大分子。此外,還可以利用Co-IP來確定在不同條件下的蛋白質相互作用。
技術原理
       免疫共沉淀是利用抗原和抗體的特異性結合以及細菌的ProteinG或A能特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在細胞裂解液中加入感興趣蛋白的抗體,孵育后再加入與抗體特異結合的結合于磁珠的ProteinG或A,若細胞中存在與興趣蛋白相結合的目的蛋白,就可以形成蛋白復合物:“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—ProteinG或A";最后通過免疫印跡實驗來檢測目的蛋白。
實驗方法

技術總結
       1、實驗樣品制備方法準備:很重要!根據研究目的,檢測樣品可能是組織樣品,也可能是細胞樣品,不同樣品制備流程不太相同,目的蛋白表達量也有較大差別,必須選擇合適的樣品和樣品制備方法;
       2、根據研究目的選擇適合的蛋白特異性抗體:非常重要!用于Co-IP實驗的抗體是針對目的蛋白的特異性抗體,理想的是選擇一種能識別興趣蛋白質某個表位的抗體,且這個表位不會被任何其他蛋白質相互作用所掩蓋,比普通WB抗體要求高出很多;同時,抗體特異性和靈敏性盡可能高,才有可能有干凈的背景和較好的IP效果,所以必須選擇適合的抗體用于Co-IP實驗;
       3、細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用,多采用非離子變性劑(NP-40或Triton-X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經驗確定;
       4、不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種酶抑制劑;
       5、使用對照抗體:單克隆抗體:正常小鼠的IgG或另一類單抗;兔多克隆抗體:正常兔IgG;
       6、確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生;
       7、要確??贵w的特異性,即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀;
       8、確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發生的,這需要進行蛋白質的定位來確定。


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