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技術文章

慢腺病毒細胞株構建科研實驗技術服務介紹

閱讀:165          發布時間:2024-9-18
慢腺病毒細胞株構建


技術原理
       慢病毒包裝:使用3質粒慢病毒包裝系統,慢病毒系統使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G,過表達慢病毒系統使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質粒系統,將質?;靹蚝笫褂昧姿徕}轉染方法轉染至HEK293T細胞中,培養48h后,收集上清。純化后留取部分檢測病毒滴度,其余病毒凍存于-80℃冰箱中。
       滴度檢測:將病毒顆粒使用梯度稀釋,分別感染293T細胞,感染72h后,在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據細胞熒光量計算病毒滴度。
       細胞感染:在病毒感染前一天對細胞進行計數,接種約10000個細胞于12孔板中,培養過夜后使用無血清培養基稀釋病毒,加入12孔板中對細胞進行感染,病毒數量根據推薦細胞的感染MOI加入(若無推薦MOI,需做病毒梯度:1,5,10,50,1005個梯度對細胞感染),感染6h后去除含病毒溶液,加入wam全培養基細胞培養,培養48h后,在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。同時加入puromycin對細胞篩選,篩選約2周時間。細胞篩選好后,使用定量PCR和Westernblot檢測目的基因的穩定表達情況。
實驗方法

技術總結:
       1、MOI(multiplicityofinfectin),感染復數,含義為感染時病毒和細胞數量的比值。多數細胞查閱文獻也能獲得推薦的MOI,但不同實驗室,不同病毒測算出的MOI也有差別。所以建議根據自己包裝的慢病毒重新檢測MOI。
       2、為了能獲得最佳效果的單克隆穩定細胞株,可以增大篩選的總量。


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