以下通用步驟可以在保持細胞完整性的同時從培養器皿中分離多種細胞系。但這一步驟不能廣泛適用于所有細胞系。應通過實驗來確定不同體系所需的佳條件和濃度。
?在傳代培養時監測細胞存活率。
?細胞存活率應大于90%。
?對于無血清培養基，建議降低胰酶用量。
1.去除器皿中原有細胞培養基。
2.用不含鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA清洗細胞。將清洗溶液加到培養瓶中與細胞相對的一側。搖動培養瓶1-2分鐘以沖洗細胞層，然后倒掉清洗溶液。
3.在培養瓶中與細胞相對的一側以2-3ml/25cm2的比例加入選定的解離溶液(見下表)。確保解離溶液能夠覆蓋整個細胞層。在37℃下孵育培養瓶。并輕輕搖動。通常細胞在5-15分鐘內解離。不同細胞系的解離時間有所不同。仔細觀測解離過程，以免損傷細胞。對于難從基質上解離下來的細胞系，可以輕敲培養瓶以加快解離過程。
4.當細胞解離時，豎直放置培養瓶使細胞流向培養瓶底部。向培養瓶中加入培養基。反復吹吸單層表面以分散細胞。計算細胞個數，然后傳代培養細胞。
注意：如果使用無血清培養基，應加入大豆胰酶抑制劑。對于0.25mg/ml的胰酶抑制劑，一般按1：1(體積比)的比例加入即可抑制胰酶。細胞
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