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幾丁質酶測試盒 

微量法100T/48S

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

幾丁質主要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動物的外殼與軟體動物的器官(例如烏賊的軟骨)，以及真菌類的細胞壁中。而幾丁質酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質水解，具有抵御真菌侵染的作用，成為抗真菌病害的研究熱點。

測定原理：

幾丁質酶水解幾丁質產生N-乙酰氨基葡萄糖，進一步與對二甲氨基苯甲醛產生紅色化合物，在585nm處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質酶的活性。

自備實驗用品及儀器

天平、水浴鍋、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、甲苯（土壤樣品專用）和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體105mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體5mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體5mL×1瓶，4℃保存。（若出現結晶，可80℃左右加熱溶解后使用）

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2. 真菌：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測。

3. 培養液：直接測定。

測定操作表：

計算公式：

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y=0.3088-0.003，R2=0.9995

計算公式：

按照樣本重量計算

酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時分解幾丁質產生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

幾丁質酶活性（mg/h/g鮮重）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=8.096×（ΔA +0.003）÷W

按照蛋白質濃度計算

酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時分解幾丁質產生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

幾丁質酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T           

= 8.096×（ΔA +0.003）÷Cpr

按細胞數量計算

酶活定義：37℃條件下，每104個細胞每小時分解幾丁質產生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

幾丁質酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣÷V樣總×細胞數量)

=8.096×（ΔA +0.003）÷細胞數量

4、按液體體積計算

酶活定義：37℃條件下，每毫升培養液每小時分解幾丁質產生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

幾丁質酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷V樣=8.096×（ΔA +0.003）

V反總：反應體系總體積，1mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.4mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL

2. 用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=0.1544x-0.003，R2=0.9995

計算公式：

按照樣本重量計算

酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時分解幾丁質產生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

幾丁質酶活性（mg/h/g鮮重）=（ΔA+0.003）÷0.1544×V反總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=16.192×（ΔA +0.003）÷W

按照蛋白質濃度計算

酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時分解幾丁質產生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

幾丁質酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T           

= 16.192×（ΔA +0.003）÷Cpr

按細胞數量計算

酶活定義：37℃條件下，每104個細胞每小時分解幾丁質產生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

幾丁質酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣÷V樣總×細胞數量)

=16.192×（ΔA +0.003）÷細胞數量

4、按液體體積計算

酶活定義：37℃條件下，每毫升培養液每小時分解幾丁質產生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

幾丁質酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷V樣=16.192×（ΔA +0.003）

V反總：反應體系總體積，1mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.4mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL

注意事項：

1. 反應結束后立即進行比色。

2. 試劑四有一定的毒性，請操作時做好防護措施。

上海牧榮生物科技有限公司

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