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檢測的每個組成部分包括一抗和二抗、封閉劑、緩沖液、酶綴合物和底物，可以對其進行優化，以提高新開發的ELISA工作方案的性能。測試了不同濃度和時間的包被、封閉、樣品培養和檢測步驟，以找到檢測的最佳條件。通常，一次測試一種成分，然而在某些情況下，可以通過應用棋盤滴定網格方法同時優化兩種成分，如下所示:

圖2:棋盤滴定網格法同時優化兩種ELISA成分。本例顯示了組件A與組件B的對比，所有其他組件保持不變。

優化涂層過程

可以在包被緩沖液中制備不同濃度的包被劑（靶抗原或捕獲抗體），并且可以應用等體積的每種濃度來執行ELISA方案，以發現強信號對低背景的趨勢。在某些情況下，根據涂布劑的性質，可能還需要優化涂布緩沖液和平板涂布時間的選擇。

優化阻塞過程

可以使用ELISA方案測試相同體積的不同制備的或市售的封閉溶液，以確保非特異性結合最少，而不會影響檢測信號強度。如果封閉溶液是內部制備的，可以調節不同濃度的封閉劑。

優化樣品濃度

用于樣品制備以生成校準曲線的標準稀釋劑應盡可能模擬天然樣品基質并測試不同的成分。用ELISA方案測試相同體積的連續稀釋樣品濃度。可以確定樣品的標準曲線濃度和稀釋線性的良好動態范圍。樣品稀釋劑可能需要根據動態范圍的光譜進行調整。

優化檢測過程

在標準稀釋液中制備的不同濃度的檢測抗體可以用ELISA方案進行等體積測試，以找到適合強信號和低背景噪聲的濃度。

辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶是ELISA中常用的兩種報告酶。在標準稀釋劑中制備的不同濃度的酶綴合物或酶綴合的二抗通過測試板中每種濃度的等體積并進行ELISA方案進行優化。可以確定產生具有最小背景噪聲的強信號的濃度。底物需要對在動態范圍內清晰檢測的靶抗原敏感，并且能夠用合適的儀器檢測。

下表列出了包被和檢測抗體及酶偶聯物的推薦濃度范圍，可用于確定比色ELISA優化的最合適實驗條件。對于酶綴合物，查看制造商的說明書以了解更具體的濃度范圍。可以使用未純化的抗體，但可能需要比純化抗體更高的濃度，并可能導致更高的背景噪聲。建議使用親和純化的抗體以獲得最佳信噪比。建議的濃度范圍僅供參考；每個組件的單獨優化將提供更好的結果。

表2:包被和檢測抗體和酶綴合物的推薦濃度范圍