RDA 用作生物樣品中 Fe 2+的選擇性高量子產率熒光標記物。它對鐵的親和力比 RPA 略低。膜滲透性化合物的陽離子熒光團允許通過例如熒光顯微鏡進行觀察，并且基于線粒體的負膜電位，尤其靶向活細胞的線粒體。在無細胞系統(tǒng)中，RDA 熒光（λ最大598 nm）會被 Fe 2+離子以化學計量（3:1）強烈猝滅。
A:無細胞系統(tǒng)中 RPA 的吸收和發(fā)射光譜（“簡單緩沖溶液"(SBS) 中的 20 µM RPA：2mM 抗壞血酸、0.15% SDS 和 10mM Tris/HCl，pH 8.2）。
B:Fe 2+對“SBS"中 RPA (20-45 µM) 熒光的影響：Fe 2+是隨著硫酸亞鐵銨/脫水檸檬酸三鈉鹽 (FAS) 濃度的增加而從添加的儲備溶液 (1mM) 中添加的。含有 20mM 抗壞血酸，與培養(yǎng)基混合。 2 分鐘后，RPA/Fe 2+復合物形成后，測定含有已知濃度的 RPA 和 Fe 2+的培養(yǎng)基部分的熒光（以任意單位 au 表示）。零熒光等于不含染料的介質的熒光。
RDA 選擇性地積聚在細胞（例如培養(yǎng)的肝細胞）的線粒體中(1,2)。當鐵以透膜形式添加到細胞中時，線粒體內 RDA 熒光會被猝滅。當添加膜滲透性過渡金屬螯合劑吡哆醛異煙酰腙和 1,10-菲咯啉后，實驗性地減少線粒體可螯合鐵時，它會增加。 RDA 熒光的增加允許使用異位校準對活細胞中的線粒體可螯合鐵進行特異性定量(1)。
Application in a cellular system
RDA 可以按照 Lit 中的描述使用。 1. 例如，在蓋玻片上培養(yǎng)的活細胞與 RDA（0.01-10 µM，由 DMSO 中的 10 µM 或 1-5 mM 儲備溶液制備）在 HBSS（“Hanks 平衡"）中于 37°C 孵育 10-20 分鐘鹽溶液"）。隨后用無染料 HBSS 洗滌細胞 3 次。為了避免 RPA 與腔室結合并改善線粒體負載，應在 RPA 負載后將細胞轉移到第二個（無指示劑）Pentz 腔室并再孵育 15 分鐘。 37°C。現在應在 37°C 下用適當的培養(yǎng)基（例如用于肝細胞的 HBBS 或 L-15 培養(yǎng)基）覆蓋細胞。使用例如定量激光掃描顯微鏡測定線粒體內RPA熒光。 RPA 的紅色熒光在 λ exc 處被激發(fā)。= 543 nm 并通過 λ exc 附近的長通濾波器收集。 = 601 納米。定量和定性測量的掃描參數取決于實驗所用的顯微鏡系統(tǒng)。測量開始后 5-10 分鐘，可通過添加 FeCl 3 /8-羥基喹啉復合物 (5-15 µM) 或膜滲透鐵螯合劑，例如 PIH（吡哆醛異煙酰腙，2mM）來控制線粒體內可螯合鐵的水平。 ) 或 1,10-菲咯啉 (2 mM)。對于對照測量，平行培養(yǎng)物加載含有一些熒光團的鐵不敏感對照 RPAC（羅丹明 B-[（菲-9-基）氨基羰基]芐酯）。應使用與上述相同的負載條件。
| 化學名稱：Rhodamine B-[(1,10-phenanthroline-5-yl)-aminocarbonyl]benzyl ester (RPA)- |
分子分子式:C 48 H 44 BrN 5 O 4
分子量 [克/摩爾]:834.7981 (79.9045+754.8935)
最大吸收:λ max (log ε) = 562 nm (4.95), 510-535
最大排放量:最大波長601 nm
穩(wěn)定:< 4 o C，干燥避光保存
外貌:紫色固體
純度:97%+（1 H NMR，500 MHz）
淬火化學計量:RPA/Fe 2+ : 3:1 [摩爾/摩爾]
體外毒性:無毒
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