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許多用于生物素化和交聯的蛋白質修飾試劑涉及通過伯胺。伯胺存在于所有蛋白質和肽中，因為它們構成N末端，也是賴氨酸殘基側鏈。胺，賴氨酸ε-胺和N-末端α-胺，是蛋白質分子中豐富的基團并且代表了生物素化最常見的靶標。例如，BSA含有59種伯胺，其中多達35種是可在分子表面獲得，并可與胺反應性酯反應.

廣泛使用的胺反應性生物素化和交聯試劑是水不溶性N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯或水溶性N-羥基磺基琥珀酰亞胺（磺基-NHS）酯。

在磺基NHS酯的N-羥基琥珀酰亞胺環上添加帶電荷的磺酸鹽（SO3-）導致它們在水（~10mM），但對質膜不滲透。質膜的溶解性和不滲透性使得它們是研究細胞表面蛋白質的理想選擇，因為它們只會與血漿外表面的蛋白質分子反應膜。

兩種形式的NHS酯在水溶液中快速水解（在pH7下7小時，在pH9下分鐘）

NHS酯類必須妥善處理和儲存。NHS酯應干燥儲存，并允許加熱至打開前的環境溫度，以避免冷凝。話雖如此，反復打開和關閉是不恰當的處理將導致濕氣的引入和NHS酯的水解。水解（和結合）導致NHS的釋放，可以通過以下程序進行分析。

方法

所需材料

•NHS酯試劑

•DMSO（類別#BKC-17）或DMF（類別#BK C-16）用于溶解NHS酯

•pH7-8的無胺緩沖液。我們建議使用磷酸鹽緩沖液，但應避免使用Tris和甘氨酸緩沖液

•0.5-1.0氫氧化鈉

•石英試管

•分光光度計設置在260-280nm

程序

1.將1-2mg NHS酯試劑溶于2ml無胺緩沖液中。準備一個含有2ml無胺緩沖液的對照管。

注：如果使用非水溶性試劑；先溶于0.25ml DMSO或DMF中，然后加入2ml無胺緩沖液。以類似方式制備對照管（0.25ml DMSO或DMF和2ml無胺緩沖液）

2.立即使用對照管將設置在260nm的分光光度計歸零，然后測量NHSester管的吸光度。

注：如果吸光度>1.0，用無胺緩沖液稀釋整個溶液，直到讀數<1.0。

3.將100µl 0.5-1.0N NaOH添加到1ml來自步驟2的NHS酯中。渦旋30秒

4.立即（1分鐘內）測量堿性水解試劑的吸光度。

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