生物素及其活化生物素經活化后，可容易地與各種抗原、抗體、酶及核酸分子中相應基團偶聯形成生物素化標記物。

①標記蛋白質氨基的活化生物素 <N-羥基琥珀酰亞胺生物素BNHS(biotiny-n-hydroxy-succinimide,bnhs)>

 此種活化生物素的制備方法是將生物素與N－羥基丁二酰胺在碳二亞胺的作用下進行縮和，生成生物素N－羥基丁二酰亞胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）。BNHS分子酯健中的-C=O基團可與蛋白質分于中賴氨酸的氨基形成肽鍵，從而使蛋白質標記上生物素。若蛋白質含賴氨酸殘基多，且等電點PI＞6時，標記效果好。因此，BNHS適用于對抗體和中性或偏堿性抗原的生物素標記。

生物素的分于量較小，當與抗體或酶反應形成生物素標記結合物后．由于大分子蛋白的空間位阻效應（steric hindrance），可對生物素與親和素間的結合以及BAS的應用效果造成干擾。可通過在生物素分子側鏈上連接一定數量的基團，形成連接臂，增加生物素與被標記大分子間的距離（如長臂活化生物素），減少位阻效應，增加檢測的靈敏度和特異性。

長臂活化生物素（N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS）是在生物素和N—羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個6-氨基己糖分子基團，形成連結臂，使其與抗體、酶等生物大分子結合后，不受位阻效應的影響，更易發揮生物索的活性作用。BCNHS的制備是先用6－氨基己糖與生物素連接制得長臂生物素，然后再將其活化。

②標記蛋白質醛基的活化生物素  生物素酰肼（biotin hydrazine，BHZ）和肼化生物胞素（biocyin hydrazine，BCHZ）
BHZ是水合肼（hydraine hydrate）與生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素標記。也可在BHZ側鏈上添加一個賴氨酸基團作為連結臂，減少標記后的空間位阻，使活化后的生物素能更好地與親和素結合。

生物胞素（biocytin）是生物素通過-C=O基與賴氨酸的ε－氨基連接而成的化合物，它與無水(空格)肼反應后形成的肼化物即為肼化生物胞素（biocytin hydrazine，BCHZ）。BCHZ除可與蛋白質的醛基結合外，它還與BNHS相同，能與蛋白質的氨基結合，因此其適用范圍較BHZ寬。

③標記蛋白質巰基的活化生物素 3-(N-Maleimidylpropionyl)biocytin3-(N-馬來酰亞胺-丙酰)-生物胞素[3-(N-maleimido-propiny)-biocytin,MPB]

能特異地與蛋白質巰基結合的活化生物素試劑。它是用氯化生物胞素與3-（N-馬來酰亞胺-丙酰）-N-BNHS在二甲基甲酰胺（DMF）溶液中反應后制得的。

④標記核酸的活化生物素

活化生物素可通過缺口移位法化學偶聯法、光化學法及末端標記法等技術使生物素的戊酸側鏈通過酰胺健與核酸分子相連構成生物索標記的核酸探針。常用于標記核酸分子的活化．常用于標記核酸的活化生物素有以下幾種：

1.光生物素（photobiotin）
光生物素是一種化學合成的生物素衍生物。生物素分子側鏈上連接的芳香基疊氮化合物基團具光敏感性，在一定波長的光照射下，光敏基團可轉變為芳香基硝基苯而直接與腺嘌呤N7位氨基結合，形成生物素化的核酸探針，用于DNA或RNA的標記。

2.生物素脫氧核苷三磷酸
先將生物索與某種脫氧枝苷酸連接成活化生物素，如生物素化dUTP（Bio-11-dUTP）。Bio-1l-dUTP作為TTP的結構類似物，可采用缺口移位法通過DNase和DNA聚合酶Ⅰ的作用而摻人到雙鏈DNA中。

3.BNHS和BHZ二者均可以在一定條件下與核酸胞嘧啶分子中的N4氨基交聯，使核酸分子生物素化。

采用BNHS和BHZ活化生物素標記核酸時，生物素偶聯的胞嘧啶N4氨基，是堿基互補時胸嘧啶與鳥嘌呤核苷酸形成氫鍵的基團，該位置連接生物素后，可影響氫鍵的形成，因此目前常用光生物素和生物素化dUTP作為標記核酸的活化生物素。