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日本乙型腦炎病毒（JEV）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
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提供商
上海晅科生物科技有限公司
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資料大小
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資料類型
WORD 文檔
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日本乙型腦炎病毒（JEV）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：日本乙型腦炎病毒（JEV）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
Name ：Japanese Encephalitis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
日本乙型腦炎，又稱流行性乙型腦炎，簡稱乙腦，是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis，JEV）引起的一種人畜共患傳染病。JEV主要是通過帶病毒的蚊蟲叮咬傳播，而豬是JEV的主要增殖宿主和擴(kuò)散宿主。JEV可引起妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)和死胎、公豬發(fā)生睪丸炎，新生仔豬發(fā)生腦炎、育肥豬持續(xù)高熱，對養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。日本乙型腦炎廣泛存在于世界許多國家，嚴(yán)重威脅著人類的健康。
本試劑盒適用于檢測的腦海馬回部組織、全血等標(biāo)本中日本乙型腦炎病毒RNA，適用于日本乙型腦炎病毒感染的輔助診斷。其檢測結(jié)果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒用一對日本乙型腦炎病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對日本乙型腦炎病毒RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
酶液 | 50μL×1管 |
JEV反應(yīng)液 | 500ul×2管 |
JEV陽性質(zhì)控品 1.69×10^8拷貝/ml | 50μL×1管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL×1管 |
注：
1） 不同批號試劑不能混用。
2） 試劑盒內(nèi)各試劑組分足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺動物的腦海馬回部組織2g；待檢活動物，抽取全血5ml
【保存和運輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100ul于1.5ml滅菌離心管中；全血樣品待血凝后取血清100ul于1.5ml滅菌離心管中。
1.2 RNA提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 | JEV反應(yīng)液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到PCR反應(yīng)管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL；熒光通道選擇：
檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 42℃ | 20min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
3 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5.結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；
可疑：檢測通道35<Ct值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為35<Ct值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。
6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：Ct>38或無Ct值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32；
以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。
7.檢測方法的局限性
? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
? 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；
? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；
? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【注意事項】
[1] 殷震，劉景 華.動物病毒學(xué)[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，1997,631~640.
[1] 金寧，胡仲明，馮書章等.人畜共患病學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2007,243~262.