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?雞馬立克氏病核酸試劑盒
馬立克氏病（MDV）是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)和增大，引起肢（翅）麻痹，以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測(cè)及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義.
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
詳細(xì)介紹
雞馬立克氏病核酸試劑盒
【預(yù)期用途】
?雞馬立克氏病核酸試劑盒
馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)和增大，引起肢(翅)麻痹，以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測(cè)及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義.
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)MDV高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。
注：陰性對(duì)照為雞基因組DNA，陽(yáng)性對(duì)照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：
(1) 咽喉拭子，采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上愕裂來(lái)回刮3次～5次，取咽喉分泌液；
(2) 泄殖腔拭子，將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便；
(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。
2.血液或血清樣品：使用無(wú)菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。
4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
5.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè)；若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
混合酶液（Taq酶+UNG酶） | 2.5 μL |
(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集MDV熒光信號(hào) |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預(yù)擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值。
【預(yù)期用途】
馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)和增大，引起肢(翅)麻痹，以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測(cè)及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義.
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)MDV高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。
注：陰性對(duì)照為雞基因組DNA，陽(yáng)性對(duì)照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：
(1) 咽喉拭子，采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上愕裂來(lái)回刮3次～5次，取咽喉分泌液；
(2) 泄殖腔拭子，將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便；
(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。
2.血液或血清樣品：使用無(wú)菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。
4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
5.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè)；若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
混合酶液（Taq酶+UNG酶） | 2.5 μL |
(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集MDV熒光信號(hào) |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預(yù)擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值。