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實時熒光定量PCR(qPCR)技術基本原理介紹
閱讀：164 發布時間：2025-5-7實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）是一種在PCR反應體系中加入熒光標記物，通過實時監測每個PCR循環中的熒光信號變化，實現對起始模板量的定量分析的技術。這項技術由美國Applied Biosystems公司在1995年推出，標志著PCR技術從定性分析到定量分析的飛躍。
實時熒光定量PCR（qPCR）的基本原理包括三個主要階段，這些階段反映了PCR擴增過程中的熒光信號變化：
1、基線期：在PCR反應開始時，熒光信號幾乎不變，主要是因為背景熒光的存在掩蓋了PCR產物的熒光信號。這一階段的熒光信號變化不大，接近一條直線，用于設置基線。
2、指數期：隨著PCR循環的進行，目標DNA序列被指數級擴增，熒光信號隨之增加。這一階段熒光信號呈指數增長，PCR產物量與起始模板量呈線性關系，是進行定量分析的理想階段。
3、平臺期：當PCR反應接近完成時，由于DNA聚合酶活性下降、底物耗盡或抑制物積累，擴增效率降低，熒光信號的增加趨于平緩，最終停止。這一階段熒光信號不再顯著增加，PCR產物達到飽和狀態。
在指數期，通過設定熒光閾值（閾值循環數，Ct值），可以準確地對樣品中的初始模板量進行定量分析。Ct值越小，說明初始模板量越大。利用標準曲線，可以將Ct值轉換為模板的起始拷貝數，實現對目標序列的定量檢測。
實時熒光定量PCR技術中有幾個重要的概念，包括擴增曲線、基線、熒光閾值和域值循環數。
1、擴增曲線（amplification curve）: 是在實時熒光定量PCR中監測到的熒光信號隨著循環數變化而繪制的一條曲線。在進行PCR反應過程中，通過檢測系統對PCR管內的樣品進行實時檢測，最后將熒光信號值通過成像技術顯現在計算機上。正常的擴增曲線包括四個階段：基線期、指數增長期、線性增長期、平臺期。
2、基線（baseline）：是背景曲線的一段，在擴增反應的最初數個循環里熒光信號變化不大，接近一條直線。
3、熒光閾值（threshold）:是在熒光擴增曲線指數增長期設定的一個熒光強度標準(即PCR擴增產物量的標準）。熒光閾值可以設定在PCR擴增的指數期。
4、閾值循環數:表示每個PCR反應管內熒光信號達到設定的熒光閾值所經歷的循環數，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，即起始拷貝數越多，CT值越小;起始拷貝數越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數的標準品可做出以起始拷貝數的對數為橫坐標,CT值為縱坐標的一條標準曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標準曲線上計算出該模板的起始拷貝數。