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實時熒光定量PCR技術必看干貨小結
閱讀：606 發布時間：2024-9-2實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。通常我們會重點關注Ct值（Cycle threshold ，Ct），其含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。
熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。其原理如下：
1、TaqMan熒光探針：
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成全同步。
2、SYBR熒光染料：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加全同步。
熒光染料也稱DNA結合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結合，游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號，但結合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數百倍的增加。隨PCR產物的增加，PCR產物與染料的結合量也增大，其熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數量。
我們將這條熒光擴增曲線人為地分為基線期、指數擴增期和平臺期三個階段:
1、基線期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所覆蓋，我們無法判斷熒光強度的變化。
2、擴增期，熒光信號呈指數增長，擴增產物的量與起始模板量存在線性關系，在此階段可定量分析。
3、平臺期，由于底物耗盡等因素.熒光信號不再呈指數增加。
RT-qPCR原理的三個主要步驟：
1 反轉錄：
使用逆轉錄酶和特定引物將RNA樣品反轉錄成cDNA。
該步驟將RNA模板轉化為更穩定且可擴增的DNA形式。
反轉錄過程中使用特定引物。
2 、PCR擴增：
使用特定引物對cDNA進行PCR擴增，這些引物環繞目標區域。
PCR是一個循環過程，呈指數級擴增DNA模板的數量。
PCR反應中包含熒光染料或探針，它們結合到擴增的DNA序列上并發出熒光信號。
3 、熒光實時檢測：
使用實時PCR儀器實時監測熒光信號。
熒光的數量與每個PCR循環中擴增的DNA數量成比例。
使用專業軟件分析數據以確定循環閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環數。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量，從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。
實時熒光定量PCR技術中有幾個重要的概念，包括擴增曲線、基線、熒光閾值和域值循環數。
1、擴增曲線（amplification curve）:
是在實時熒光定量PCR中監測到的熒光信號隨著循環數變化而繪制的一條曲線。在進行PCR反應過程中，通過檢測系統對PCR管內的樣品進行實時檢測，最后將熒光信號值通過成像技術顯現在計算機上。正常的擴增曲線包括四個階段：基線期、指數增長期、線性增長期、平臺期。
2、基線（baseline）：
是背景曲線的一段，在擴增反應的最初數個循環里熒光信號變化不大，接近一條直線。
3、熒光閾值（threshold）：
是在熒光擴增曲線指數增長期設定的一個熒光強度標準(即PCR擴增產物量的標準）。熒光閾值可以設定在PCR擴增的指數期。
4、閾值循環數:
表示每個PCR反應管內熒光信號達到設定的熒光閾值所經歷的循環數，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，即起始拷貝數越多，CT值越小;起始拷貝數越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數的標準品可做出以起始拷貝數的對數為橫坐標,CT值為縱坐標的一條標準曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標準曲線上計算出該模板的起始拷貝數。