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實(shí)驗(yàn)提取質(zhì)粒DNA方法
閱讀：1783 發(fā)布時(shí)間：2019-12-27提取質(zhì)粒DNA的方法有很多種，從提取產(chǎn)量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取，從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取，從具體操作方法分可以分為堿裂解法、煮沸法、牙簽法等，各種不同的方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢圆捎煤线m的提取方法。
堿裂解法:人們使用堿與SDS裂解法從E. coli(大腸桿菌)中分離制備質(zhì)粒DNA已有30多年的歷史。將細(xì)菌懸浮液暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會(huì)使細(xì)胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對(duì)*破壞，閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會(huì)彼此分離，這因?yàn)樗鼈冊(cè)谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。只要OH-處理的強(qiáng)度和時(shí)間不要太過，當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時(shí)，DNA雙鏈就會(huì)再次形成。
質(zhì)粒DNA煮沸法:是將細(xì)菌懸浮于含有Triton X-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶的緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細(xì)菌外壁，還有助于解開DNA鏈的堿基配對(duì)，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是。閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈彼此不會(huì)分離，這是因?yàn)樗鼈兊牧姿岫ス羌芫哂谢ハ嗬p繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。當(dāng)溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各就各位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。煮沸裂解法對(duì)于小于15kb的小質(zhì)粒很有效，可用于提取步至lmL(小量制備)，多至250mL(大量制備)菌液的質(zhì)粒，并且對(duì)大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
質(zhì)粒小提試劑盒:用于大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的小量提取，它結(jié)合了優(yōu)化的堿裂解法，以及方便快捷的硅膜離心技術(shù)，具有高效，快捷的特點(diǎn)，能在30min內(nèi)完成全部操作。利用試劑盒能從1-5mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液中純化得到10-40μg高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(OD260/OD280=1.7-1.9)，此質(zhì)粒DNA可直接用于DNA序列分析，各種酶促反應(yīng)，PCR以及部分細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染等。