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安捷倫科技發布關鍵質量屬性(CQA)

閱讀:1052          發布時間:2018-10-13

安捷倫關鍵質量屬性(CQA)是生物學特征,會影響安全性和有效性,必須得到密切監測,因此需要使用各種分析技術對分子進行大量測試。

定義太空洞?當我們在談論關鍵質量屬性時我們在談論什么?今天來談談滴度測定和電荷異構體分析。CQA 檢測中,除了聚集體分析至關重要之外,滴度測定和電荷異構體分析也分別起到不同的作用。

 

滴度測定:
滴度測定雖然不直接測量 CQA,但常作為生物治療蛋白生產的步質量檢查。異常滴度可反映細胞株或培養基存在的問題,這些問題可能會導致異質性或產品出錯而不僅是降低產率。使用 UV 檢測的 Protein A 親和捕獲色譜是生物制藥中用于單克隆抗體 ( mAb )滴度測定的一種普遍方法。許多實驗室選擇基因修飾的重組 Protein A 平臺,因為重組蛋白質通常更穩定,有更長的色譜柱壽命。天然(純化)Protein A 的吸引力在于對某些 IgG 具有更緊密的結合親和性。Protein A 產品可用作預裝填柱、整體床柱和供用戶填裝使用的松散介質。整體床色譜柱具有更大孔徑的篩板,因此不易堵塞,對復雜樣品基質更加耐用。

異常滴度可能需要分析用過的細胞培養基,以排除低產量的原因。氨基酸是培養基的主要成分,可以通過多種技術進行分析,常見的是利用 LC/UV 分析衍生化氨基酸。衍生化技術的優點是可以廣泛應用,并可通過反應化學引入一定程度的特異性,但是人們對分析未衍生化氨基酸以大限度縮短樣品前處理時間也越來越感興趣。未衍生化氨基酸不具有 UV 吸收,因此需要用到其他檢測器,如蒸發光散射 或質譜 ( MS ) 檢測器。

然而,僅能達到低納摩爾水平,而衍生化氨基酸的 UV 檢測可以達到低皮摩爾水平。MS 分析檢測也能得到更高的靈敏度,在數量級上實現提升。雖然MS 儀器的成本一直是此方法廣泛使用的阻礙,但其引發的越來越廣泛的關注已經使供應商開始在市場中引入經濟實惠且切合實際需求的質譜儀。

隨著 MS 更廣泛的使用,快速有效地分離分子量較小的極性分子成為一個需要克服的挑戰。使用反相色譜柱分析離子對可得到非常穩定的結果,但需要儀器。過去, 親水相互作用色譜 ( HILIC ) 一直在努力滿足市場對穩定性和重現性的要求,而近推出的色譜柱在這方面已經有了重大改進。

 

安捷倫關鍵質量屬性電荷異構體分析:
使用 UV 檢測的離子交換色譜 ( IEX ) 常用于分離由 PTM(如賴氨酸截短、脫酰胺或唾液酸化)產生的電荷異構體。此項分析通常也在完整蛋白質水平上進行,因為這種變化可以被檢測到,但無法進行特定的鑒定和定位,IEX 通常使用鹽梯度來進行,這些高濃度的非揮發性鹽不適用于 MS。因此,一個新的關注點是使用 pH 梯度而非鹽梯度,這樣便可以使用低濃度且可以有效揮發的緩沖鹽流動相,以便和 MS 聯用。為了保留樣品,IEX 要求樣品具有與固定相相反的極性電荷。鹽梯度 IEX 使用高濃度鹽來破壞這些離子的相互作用并洗脫分析物。pH 梯度必須跨越分析物的等電點 ( pI ),以便蛋白質在電中性時被洗脫。盡管線性 pH 梯度難以重現,但 pH 梯度可以將分析物

聚集到較窄的譜帶中,從而獲得比鹽梯度更高的分離度。由于必須非常地控制并適當地選擇流動相 pH、離子強度和梯度組分,可靠的 IEX 方法開發具有挑戰性。通常需要進行大量的方法開發,但可以利用軟件來篩選僅由少量儲備液制備的復合緩沖系統的梯度,從而簡化方法開發。

毛細管等電聚焦 ( cIEF ) 也常用于電荷異構體分析。類似于 pH 梯度 IEX,cIEF 也是基于 pI 進行蛋白質異構體分離,是一項驗證 IEX 結果的常用技術。

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