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快速高分離度 LC/MS/MS 定量測定麥片中的水溶性 B 族維生素
閱讀：599 發布時間：2023-4-16引言水溶性維生素極性很強，在反相色譜柱上保留很差。在流動相中加入離子對試劑，如七氟丁酸能夠明顯改善這類化合物的分離和保留。然而，使用這類離子對也有缺點，它會在質譜儀中產生較高的背景信號。因此，我們使用具有專門保留親水性化合物鍵合相的色譜柱，在流動相溶劑中加入甲酸銨，開發出快速靈敏的分析方法。本文使用的 Agilent 1200 系列液相色譜（LC）系統和亞-2-微米填料色譜柱用于快速高分離度分離。該LC 系統設計降低了延遲體積，增加了壓力范圍和柱溫。將該 LC 系統通過 G1948B 電噴霧離子源與Agilent 6410 三重串聯四極桿質譜儀（QQQ）相連接。目標化合物采用加入甲酸銨的水 - 甲醇梯度在ZORBAX AQ 1.8 µm 色譜柱上實現分離。測定水溶性維生素的普通的 LC/MS 方法是在流動相溶劑中加入七氟丁酸作為離子對試劑，其分析時間長達 30 分鐘。我們開發出快速、靈敏的 LC/MS/MS液質聯用儀 方法用于水溶性維生素的測定，該法采用高效 1.8 µm色譜柱在低擴散、600 bar LC/MS 配置下將允許篩選和定量的運行時間周期低至 10 分鐘。質譜儀的線性響應超過三個數量級，除吡哆醇外的所有被測物具有0.5 pg/µL 的定量限。吡哆醇的分析具有良好的靈敏度，但良好的線性恰好被局限在三個數量級之內。對于除吡哆醇之外的所有化合物得出了濃度介于0.5 ～ 500 pg/µL 之間（吡哆醇介于 0.5 ～ 250 pg/µL之間）的校正曲線和色譜圖。B 族維生素的結構示于圖 1。
實驗部分樣品制備含有所有八種化合物的混標甲醇溶液由 ConAgra 食品公司提供，使用含 20 mM 甲酸銨和 0.1% 甲酸的10% 甲醇水溶液稀釋至如下濃度：500、250、100、50、5 和 0.5 pg/mL。這些稀釋液用于未知樣品的定量測定。再提供一種按下列方法制備的添加 B 族維生素的樣品，制備方法如下：
使用攪拌器將早餐麥片研磨均勻；2. 稱取 1 克研勻的樣品轉入 50 mL 樣品瓶中；3. 加入 25 mL 0.1 M HCl，在 100 °C 水浴中加熱 20分鐘，以溶解維生素；4. 冷卻至室溫；5. 用去離子水調整體積至 1 L ；6. 用 0.45 µm 玻璃微纖維素膜過濾。應該指出，提供的添加樣品是為測試儀器的靈敏度而研制，以向顧客演示為目的。一種典型的未添加樣品的提取由以下步驟組成：取 1 克研勻的樣品用酶消化處理以將天然存在的維生素從其結合形式中釋放出來，定容至 10 mL，取其體積的 1/100 用于本研究所分析的添加樣品。在較高的濃度下，可看到鹽和其它基質成分對某些維生素的分析產生干擾。因此，可以采用進一步稀釋的辦法調節這些樣品中的基質效應。
維生素 B12 母離子的質量（m/z 678.6）大約是圖 1中給出的該化合物實驗式（C63H88CoN14O14P）計算值的一半。相信此化合物不太穩定，在離子化過程中發生了裂解。
結果與討論 ：有八個化合物的校正曲線示于圖 2A ～ 2H。只有化合物吡哆醇在 500 ppb 水平沒有得到良好的線性，本實驗未加內標。