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液質聯用檢測牛奶中的重組牛生長素
閱讀：841 發布時間：2023-4-6引言重組牛生長素 (rbST)，也稱為生長激素，用于產奶母牛以提高牛奶產量。不同的法規對它的使用都有所規定，但由于缺少對其進行檢測的有效方法 [1]，使得這些法規難以得到應用。這可能引發動物添加劑和食使用 LC-ESI-MS/MS 檢測牛奶中的重組牛生長素應用品安全方面的國際爭端。事實上，使用了這種激素的乳牛所產的奶中可能存在 rbST 殘留。為了檢測牛奶中的 rbST 殘留，已確定選擇對胰蛋白酶水解的 rbST N 末端肽鏈進行分析，尤其是針對內源性激素與重組激素所存在的差異。內源性牛生長激素的 N 末端氨基酸為丙氨酸，而在重組形式中則被蛋氨酸取代。本文闡述了使用 ESI(+)LC-MS/MS 檢測 rbST 的方法。該方法成功應用于加有 rbST 標樣的牛奶樣品提取物。
實驗部分蛋白質和肽類標準品rbST 蛋白質標準品和重組馬生長素 reST(EquiGen-5) 分別來自 Harbor-UCLA Medicalcenter, National Hormone and Pituitary Program(Torrance, CA, USA) 和 Bresagen Limited 公司(Thebarton, Australia)。以下序列的肽類標準品由 Millegen 公司 (Labege,France) 合成：MFPAMSLSGLFANAVLR (胰蛋白酶水解的 rbST N 末端肽鏈）、MFPAMPLSSLFANAVLR(胰蛋白酶水解的 reST N 末端肽鏈) 和 AFPAMSLSGLFANAVLR (胰蛋白酶水解的 bST N 末端肽鏈)。
儀器設備用于 N 末端肽鏈檢測的儀器設備及設置如下表所示。
LC儀器 Agilent 1200色譜柱 Column Interchrom ModuloCart QSUptisphere 3HDO 150 mm × 2 mm流動相 A: 乙腈+0.1% 甲酸溶液B: 水+0.1% 甲酸溶液流速 0.3 mL/min進樣量 20 µL梯度 時間（分鐘） %A0 105 5510 6015 10017 1020 10MS儀器 Agilent 6410 LC/MS 三重串聯四極桿電離模式 ESI (+)毛細管電壓 5000 V霧化器壓力 55 psi氣流 13 L/min氣體溫度 300 °C
選擇性反應監測分析 (SRM) 方法參數為了獲得較好的特異性，在 SRM 模式下進行檢測。監測的 transition 如表 1 所示。
結果和討論三重串聯四極桿 MS-MS 和電噴霧電離模式方法學的應用在本方法中，選用了正離子模式的電噴霧電離。事實上，這種表現為“軟"電離技術的電離模式對于肽類檢測最為合適。rbST N 末端肽鏈的電離產生兩種主要離子形式 (z=2 或 z=3)。這種基于三重串聯四極桿質譜的方法學應用具有很好的靈敏度和選擇性，并且有可能對所監測信號實現定量分析。不同化合物的分離所開發的這種檢測方法不僅用于 rbST 的胰蛋白酶水解 N 末端肽鏈的檢測，還用于內源性腦垂體牛生長素 (bST) 和 reST 的胰蛋白酶水解 N 末端肽鏈的檢測。reST 被用作內標，因為它的氨基酸序列與rbST 具有高度的相似性。三種化合物得到了色譜分離，并用表 1 的 transition進行分析。進樣量為 0.2ng, bST、rbST 和 reST N 末端肽鏈所對應的色譜圖如圖1所示。
低，但仍然是有效的，能夠清楚而明顯地顯示出來。本方法顯然能夠用于牛奶中 rbST 的準確鑒定。
結論牛奶中的 rbST 通過 ESI(+)LC-MS/MS 得到了檢測。該方法顯示了非常好的靈敏度、特異性和穩定性。按照 2002/657 號法令中的限度要求，使用該方法成功地對加有 50ng.mL-1 rbST 的牛奶樣品進行了檢測。