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使用 GC/MS篩選中藥中 430 種殘留殺蟲劑
閱讀：666 發布時間：2023-4-5引言中藥在中國的應用已有數千年歷史 ，在中國和其他國家顯示了非常好的治療效果 。與以往相比 ，越來越多的中藥材在農場中進行大規模的栽培 。農場使用的殺蟲劑應得到監測 ，以確保其殘留量在安全范圍內 。中藥的基質非常復雜 ，并且常用的殺蟲劑有好幾百種 ，但是其殘留量卻非常小 。由于這些因素的存在 ，在短時間內完成殘留殺蟲劑的篩選成為非常困難的一項任務 。這一問題的解決涉及以下幾個步驟 ，包括樣品預處理 、儀器采集 、數據處理和報告生成 。使用氣相色譜/質譜聯用儀（GC/MS）的基本要求如下 ：1. 有效而且簡單的樣品制備方法2. 重復性好而且可重現的保留時間3. 包含保留時間和質譜信息的數據庫QuEChERS 是由 Dr. Steven J. Lehotay 和他的同事們開發的一種食品中殺蟲劑分析方法 ，由 Quick（快速 ）、Easy（簡便 ）、Cheap（經濟 ）、Effective（有效 ）、Rugged（穩定 ）和 Safe（安全 ）的首字母縮寫而命名[1-5]。這里之所以選擇 QuEChERS，是因為和傳統方法相比 ，它具有很多優點 ，例如對于極性和揮發性不同的殺蟲劑有高回收率 ，樣品通量大 ，有機溶劑用量小 ，不使用氯化物作溶劑[1-5]。QuEChERS 滿足上述第 1 條基本要求 。保留時間鎖定（ RTL） [6]指在不同的 Agilent6890/7890 GC 系統中使用相同牌號色譜柱 ，仍然獲得非常接近的色譜保留時間的能力 。Agilent 7890GC 的保留時間重復性尤其出色 ，偏差小于 0.01 分鐘 。RTL 能夠使不同儀器的保留時間精確地匹配 ，滿足上述第 2 條基本要求 。
2005 年 11 月 29 日 ，日本厚生?。∕HLW）頒布了一套有關殺蟲劑 、飼料添加劑和獸藥管理的“肯定列表（Positive List）”制度 。該制度是世界上有關殺蟲劑嚴厲的法規 。按照該法規 ，安捷倫開發了一種新型數據庫 ，名為“日本肯定列表保留時間鎖定數據庫（the Japanese Positive List RTLDatabase）”，其中包括了日本肯定列表中所有適用于氣相色譜分析的殺蟲劑 ，以及日本檢疫機構監測的其它殺蟲劑 。該數據庫中包含各種殺蟲劑的保留時間和光譜信息 ，因此滿足上述第 3 條基本要求[7]。另外 ，篩選方法還應滿足以低的假陽性和假陰性率對殺蟲劑進行快速確認的要求 。安捷倫解卷積報告軟件（DRS）[7]設計用于從基質中對質譜進行自動解卷積 ，從而生成定性和定量報告 。 DRS 整 合 來 自 三 個 方 面 的信息 ： MSDChemStation、 自 動 質譜解 卷 積 和 鑒 定系統（AMDIS），以及美國標準與技術研究院（NIST）質譜數據庫檢索 。DRS 增強了從復雜基質中獲得結果的信心 ，一般的數據處理時間只需 2～3 分鐘 ，很好地滿足了以上所提的更高要求 。本文闡述了如何應用以上技術手段來開發中藥基質中殺蟲劑篩選的一整套方法 。研究的目標包括中藥的不同藥用部位 ，如金銀花的花 、黃芪的根和莖 、銀杏葉的葉 、人參的根和枸杞的果實 。通過約 20 分鐘的 QuEChERS 預處理 ，所得提取物注入 Agilent7890A/5975C。運行日本肯定清單測試方法 ，并采用反吹技術 ，運行時間約 37 分鐘 。最后 ，利用日本肯定清單 RTL 數據庫 ，經過 2～3 分鐘的 DRS 處理 ，自動生成一份定性定量報告 。
實驗部分中藥材購自當地藥店 ，包括金銀花 、黃芪 、銀杏葉 、人參和枸杞 。所有樣品均研成細粉 。樣品制備• 稱取中藥材細粉 1 g，置 50 mL 聚四氟乙烯試管中 ，加入蒸餾水 6 mL，使樣品潤濕 ，并于室溫中存放 2 小時• 加入 0.1%的冰醋酸乙腈溶液 4 mL，用手劇烈振搖1 分鐘 ，然后加入硫酸鎂 1.2 g、氯化鈉 4 g，繼續用手劇烈振搖 1 分鐘后 ，以 4000 rpm 轉速離心 3 分鐘• 取 PSA（部件號 5188-5364）500 mg、C18（部件號 189-1302）250 mg、硫酸鎂 250 mg，置5 mL 離心管中 ，接著移取上述提取液的上清液1.5 mL 至離心管中 ，以 3000 rpm 轉速離心 1 分鐘 。如果離心后溶液呈黑色 ，可加入石墨化碳黑以吸附其中的色素（如葉綠素 ）• 移取提取液 1.0 mL 至 GC 樣品瓶中如果在篩選后還需要進行專屬的定量分析 ，可在最終溶液中加入分析保護劑和內標物質 。GC/MS日本肯定清單方法由日本厚生省發布 ，用于所有日本生產和進口的農產品中殺蟲劑的檢測 。本文中 ，對該方法進行改進 ，加上反吹過程 ，用以處理復雜的中藥基質 。方法參數詳見表 1。系統的軟件要求Agilent MSD ChemStation (部件號 G1701EA, Ver.E.02.00)、安捷倫解卷積報告軟件(部件號 G1716AA,Ver. A.04.00)、 NIST05b 質譜數據庫 (部 件 號G1033A)，包括 NIST MS Search (Ver. 2.0d) 和AMDIS (Ver. 2.65)，以及安捷倫日本肯定列表殺蟲劑RTL 數據庫 (部件號 G1675AA)。
結果與討論用于多種中藥基質的 QuEChERS 方法優化在中藥制劑中 ，可以選擇中藥材不同的可食用部位入藥 。另外 ，中藥基質的化學成分復雜 ，含有皂苷 、多糖 、黃酮 、酚酸以及脂肪酸等 。因此 ，測定如此復雜的中藥基質中的殘留殺蟲劑是一項艱巨的任務 。本次研究中 ，首先對金銀花進行了考察 ，隨后 ，為了在化學成分方面更具代表性 ，將不同的中藥混合在一起 。選擇了 5 種中藥材進行混合 ，分別是金銀花 、黃芪（根和莖 ）、銀杏葉 、人參（根 ）和枸杞子 。
QuEChERS 方法中 ，吸附劑的用量對于殺蟲劑的回收率有很大的影響 。已經證明 ，PSA 在處理中藥提取物的酸性成分方面更為有效 。通過對 PSA 不同劑量的篩選發現 ， 500 g 的用量已經足夠 。經QuEChERS 處理的混合中藥樣品典型色譜圖見圖 1。
微板流路控制技術產生的反吹作用在復雜的中藥基質分析研究中的應用反吹作用通過改變色譜柱中載氣流的方向 ，將高沸點物從色譜柱入口端沖出 。經證明 ，這種反吹作用能夠有效地消除一次次運行產生的化學噪聲 。通常 ，高沸點物留在色譜柱的前端 ，只有將柱溫升至足夠高 ，才能把它們趕出色譜柱 。長時間高溫烘烤色譜柱易使色譜柱填料嚴重流失 ，導致色譜柱壽命縮短 。有些復雜基質 ，即使長時間烘烤仍然無法除去高沸點物 ，則可能在下一次進樣時發生保留時間漂移 。反吹是避免高溫烘烤和保留時間漂移的最高解決方案 。反吹能程度地減小對檢測器的污染 ，這對于質譜檢測器尤為重要 ，因為它可以減少離子源的清洗次數 。反吹的另一個積極貢獻在于它能縮短運行周期 ，從而提高實驗室的效率 。有關反吹作用的詳情 ，包括方法開發步驟 ，可參見安捷倫相應的應用報告[8]。本實驗中 ，使用帶尾吹氣的三通分流器來實現反吹作用 。該裝置有特別的尾吹氣補充管路和四個接口 ，一個接色譜柱 ，另三個可與三個不同檢測器的限流管相連 。由于本次研究中僅用到一個質譜檢測器 ，尾吹氣前兩個接口被封上 ，第三個接口連接色譜柱 ，最后一個接口連接限流管 。這樣設置的主要目的是避免由于死體積的增大而引起色譜峰展寬 。限流管的長度和內徑分別為 0.706 m 和 0.18 mm。該裝置和 GC/MSD 系統設置示意圖見圖 2。中藥基質中目標殺蟲劑的 DRS 鑒定殺蟲劑分析的另一個挑戰 ，是在復雜的基質中對痕量的目標化合物進行鑒定時 ，通常受到很高的化學噪音的干擾 ，得到的譜圖庫匹配因子很低 。為改善匹配因子 ，以前常用的方法是背景扣除 ，然而 ，這種方法同時受到基質情況和檢測人員水平的影響 ，有時會給出不一致的結果 。
安 捷 倫 于 2004 年 投 入 應用的解 卷 積 報 告 軟 件（DRS）是一個軟件包 ，將三個不同數據處理軟件信息整合成易于閱讀的報告 。DRS 的最主要優點是大大縮短了從復雜的基質分析中解讀結果所需的時間 。然而 ，一個合適的數據庫對于成功運用 DRS 非常重要 。日本肯定清單 RTL 數據庫是用于殺蟲劑分析的新型 DRS 數據庫 ，包含 430 種適用氣相色譜分析的殺蟲劑的保留時間和質譜信息 。數據庫的詳細信息參見安捷倫的應用報告[7]。中藥基質中殘留殺蟲劑分析的數據處理和報告生成 ，優先推薦使用 DRS 與日本肯定列表 RTL 數據庫 。圖 3 是加標混合中藥樣品的典型 DRS 報告的一部分 。圖 4 顯示了分析中藥基質殘留殺蟲劑時使用 DRS 的優勢 。在混合中藥樣品中加入 10 ppb 濃度水平的甲基嘧啶磷 。該化合物被 MSD ChemStation 漏過了 ，卻由 DRS 成功檢出 。上方窗口是總離子色譜圖（TIC），中間窗口是第 2199 次掃描（13.981 分鐘 ）時有干擾的原始光譜 ，下方窗口是解卷積光譜（白色曲線 ）和日本肯定列表清單 RTL 數據庫中甲基嘧啶磷光譜（黑色曲線 ）的對比 。經過解卷積 ，第 2199 次掃描的光譜圖變“干凈”了 ，從而能從混合中藥樣品中輕松鑒定出甲基嘧啶磷 。
結論痕量水平殺蟲劑分析最主要的干擾就是復雜中藥基質中的化學噪聲 。本文采用了幾種新技術以消除這些干擾 。成熟的樣品制備方法是盡可能地去除化學噪聲的主要途徑 。應用 QuEChERS 方法使樣品制備步驟得到了簡化 ，提高了實驗室的效率 ，整個處理過程僅需 20 分鐘左右即可完成 。然而 ，即使應用了有如 QuEChERS 這樣的預處理方法 ，仍然不能除去化學噪聲 。反吹是另一種可以消除一次次運行中化學噪聲的方法 。盡管反吹不是一個新的概念 ，但是應用微板流路技術能夠比以往更有效地實現反吹作用 。本研究中 ，一種帶尾吹氣的三通分流器用于實施反吹作用 ，帶反吹的數據采集時間約為 37 分鐘 。在數據處理過程中與化學噪聲有關的最后一步利用了一種解卷積的算法 。安捷倫的解卷積報告軟件能夠將數據處理時間縮短至 2～3 分鐘 ，同時應用了日本肯定清單 RTL 數據庫 ，對于中藥基質中殺蟲劑的分析十分有效 。從樣品預處理到生成篩選報告 ，整個中藥基質中 430 種殘留殺蟲劑的篩選僅需 1 小時即可完成 。
