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用高分離度快速液相色譜對三七進行快速、
閱讀：430 發布時間：2023-3-16摘要本應用報告報道了：• 高分離度快速液相色譜（RRLC）分析三七方法的方法建立• 從常規HPLC到RRLC方法轉換的結果• 用RRLC方法在保持復雜組分良好分離度的同時，縮短了分析時間，同時提高了樣品通量、降低了成本• 用優化方法得到的色譜圖顯示，從三七不同部位得到的樣品色譜峰輪廓不同，某些皂甙的濃度也不同
前言中藥（TCMs）具有悠久的用藥歷史，其療效在中國及韓國、日本等亞洲國家都得到認可。在西方國家，也越來越普遍地將中藥作為食品添加劑或營養補劑。被使用過的中藥已經有11,000多種。對中藥的研究和質量控制很大程度上依靠儀器分離和分析的性能。本研究建立了一種分析三七的高分離度快速液相色譜(RRLC)方法。用安捷倫方法轉移器輕松地將常規HPLC 分析方法轉為 RRLC 方法。用不同提取方法從三七植物的不同部位制備不同樣品 。用優化的方法分離這些樣品，得到的色譜圖顯示了不同的色譜峰輪廓。本應用報告還報道了定量結果。質控部門使用本研究中建立的更快、更好的方法，將縮短分析時間，提高樣品通量。使用這些方法還能節省溶劑消耗，改善整個分析過程。三七，中文名三七或田七，在中國是一種重要而昂貴的藥材。它已經有400多年的栽培歷史，85%以上的三七都產自中國云南省。三七的功效在于促進血液循環、去除血液瘀積包括凝血，治療腫脹、緩解疼痛。最近的藥理學研究顯示，三七具有抗癌和保肝作用，如，對心血管和腦血管系統有保護作用1。三七的皂甙種類與著名的人參和西洋參 (花旗參)相似，因為它們都屬于同一種屬。三七主要用于中國南方的不同驗方。著名的中成藥云南白藥和片仔癀中也含有三七。中藥的復雜基質常常給質量控制和研究帶來挑戰。2005版中國藥典收載了藥材三七及其復方制劑，如三七傷藥片，其中含有三七皂甙R1，是這些制劑中必須分析的成分。三七皂甙的分析時間一般是 60 多分鐘。隨著對中藥的研究越來越深入，科學家們認為只控制1到2個成分還不足以確定中藥的質量，必須開發分離更多組分的質量控制方法。像中藥這種復雜樣品的分離比合成藥物的分離需要更長的分析時間。當需要考慮樣品通量問題時，理想的解決方案就是在較短的分析時間內達到相似或更高的性能。使用RRLC有可能開發出分析時間更短、性能更好，又節省溶劑的方法。對于生產質量控制來說，使用RRLC意味著產品批次的檢定出廠可以比使用常規HPLC方法更快。
實驗儀器用于開發 RRLC 方法的 Agilent1200系列高分離度快速液相色譜系統包含以下組件：Agilent 1200系列 RRLC系統包括：• Agilent 1200 系列SL型二元泵，帶真空脫氣機• Agilent 1200系列SL型高性能自動進樣器• Agilent 1200 系列SL型柱溫箱• Agilent 1200 系列SL型二極管陣列檢測器，配置微量流通池(2 µL體積，3 mm光程)• Agilent 化學工作站 B.02.01SR1，用于數據采集和分析• Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色譜柱，4.6 x 50 mm, 1.8 µm粒徑常規HPLC為標準配置Agilent 1100系列液相色譜，包含以下組件：• Agilent 1100 系列二元泵，帶脫氣機• Agilent 1100 系列自動進樣器• Agilent 1100 系列柱溫箱• Agilent 1100 系列二極管陣列檢測器• Agilent ZORBAX SB C18色譜柱，4.6 x 50 mm, 5 µm粒徑
三七皂甙 R1、人參皂甙Rg1和人參皂甙Rb1標準品購自中國國家藥品與生物制品檢定所(NICPBP)，人參皂甙Re和人參皂甙Rc標準品購自美國SigmaAldrich公司。• 三七莖葉提取物(NCLE)由用戶實驗室提供。莖和葉用60%乙醇提取，溶劑蒸干后殘渣用正丁醇溶解，再將溶劑揮發掉，殘留黃色粉末用甲醇溶解，待進樣。3• 三七根提取物（NRE）由用戶實驗室提供。粗品用水提取，用大孔濾膜過濾，濾液揮發至干。殘留白色粉末狀物質用甲醇溶解，待進樣。• 三七購自當地一家藥材商店（品牌為同仁堂）。粗品用水/甲醇(30/70, v/v)超聲萃取30分鐘，用0.22微米濾膜過濾，用澄清的濾液進樣。• 水、乙腈和甲醇均購自美國Fisher公司。
方法轉換需要將使用填充5 µm填料色譜柱的常規HPLC方法轉換成使用填充1.8 µm填料色譜柱的RRLC方法。使用安捷倫方法轉換計算器( 可用光盤，Agilent 1200系列高分離度快速液相色譜系統，發行號5989-5130EN)，可使這一過程簡便、快速(圖1)。方法轉換計算器上列出了各種不同參數，可以根據具體需求對轉換后的方法進一步改進。如需了解如何將一個常規HPLC方法手動轉換成RRLC方法，請參閱安捷倫相關應用報告2,3,4。
結果與討論色譜圖藥理學研究結果顯示，三七植物的不同部位因所含的成分不同具有不同的藥效。使用特殊的提取方法以達到獲得更多有效成分的目的。用常規HPLC方法和RRLC方法分析三七樣品得到不同的峰輪廓。圖2顯示了用常規HPLC方法分析三七莖和葉提取物(NCLE)得到的色譜圖。這種分析通常需要60多分鐘5。如實驗部分所述，用于分析三七樣品的RRLC方法是在常規HPLC方法的基礎上開發的。用常規HPLC方法和 RRLC 方法分析了相同的NCLE樣品。色譜圖見圖2和圖3。圖 3 中的色譜峰比圖 2 中的更窄。這意味著分離復雜樣品的峰容量增加了。RRLC分析的分離度或分離性能優于常規HPLC。同時，分析時間從60分鐘明顯縮短到20分鐘。另一個要考慮的因素是常規HPLC和 RRLC 柱的選擇性應保持一致。如果新的RRLC柱與常規HPLC柱相比具有不同的選擇性，方法轉換將失去意義。在本研究中，峰輪廓和洗脫順序都相同，所以不需要再對新色譜圖中的峰進行鑒定。而且，二極管陣列檢測器得到的UV 光譜圖將有助于進一步對色譜峰進行確證。