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前言：維生素是一類小分子化合物，需要量不大但確非常重要，對于保持正常的健康和生長具有特殊的作用。因?yàn)榫S生素不是由人體自然合成的，因此必須保持平衡的飲食以保證維生素的攝取水平。然而，有時(shí)候飲食習(xí)慣會(huì)造成維生素的缺乏。在這種情況下，市售復(fù)合維生素片可以適當(dāng)對其進(jìn)行補(bǔ)充。雖然缺乏維生素會(huì)引起的疾病，但是過量的維生素也會(huì)損害身體健康。食品和藥物管理局 (FDA) 要求對復(fù)合維生素片中的維生素進(jìn)行標(biāo)注。這就尤為需要開發(fā)一種能夠定量分析維生素進(jìn)行 FDA 營養(yǎng)標(biāo)注的有效方法了。許多不同的傳統(tǒng)分析方法可以分析單個(gè)或少量的維生素。其中大多數(shù)方法需要繁重的，長時(shí)間的樣品制備，而且是非特異性的。由于不同維生素的化學(xué)性質(zhì)不同，因此同時(shí)進(jìn)行可靠的多種維生素分析是非常困難的。而且由于維生素片中的濃度范圍較寬，從幾微克到幾十毫克，這樣就使分析工作更加難以完成了。另外，某些維生素還具有穩(wěn)定性、基質(zhì)復(fù)雜性以及溶解性等問題。本文描述了一種簡單、可靠的采用紫外檢測同時(shí)測定 10 種水溶性維生素的方法，只需 20 分鐘即可完成。

方法儀器和軟件采用 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統(tǒng)，包括以下部分：• Agilent 1260 系列四元泵和真空脫氣機(jī) (G1311B)• Agilent 1260 系列高效自動(dòng)進(jìn)樣器(G1367E)• Agilent 1260 系列柱溫箱 (G1316C)• Agilent 1260 系列二級(jí)管陣列檢測器(G4212B)，配置最大光強(qiáng)流通池 (光程60 mm) (G421260007)• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱3.0 mm × 150 mm，2.7 µm（部件號(hào)693975302）• 使用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)開發(fā)并實(shí)驗(yàn)超高液相色譜分析方法• Agilent 1290 Infinity 二元泵配備內(nèi)置的真空脫氣機(jī) (G4220 A) 以及 100 µLJet Weaver 混合器• Agilent 1290 Infinity 高效自動(dòng)進(jìn)樣器(G4226A)• Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)• Agilent 1290 Infinity 二級(jí)管陣列檢測器 (G4212A)，配置最大光強(qiáng)流通池 (體積 1.0 µL，光程 10 mm) (G421260008)• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，內(nèi)徑 2.1 mm，長 75 mm，采用 2.7 µm粒徑填料填裝 (部件號(hào) 697775902)兩個(gè)系統(tǒng)控制都采用 Agilent ChemStationB.04.02 軟件。

試劑和材料所有的化合物和溶劑均為色譜級(jí)純度，超純水使用 Milli Q 水純化系統(tǒng) (MilliporeElix 10 model, USA) 制得。乙腈梯度級(jí)別，購自 LabScan 公司 (Bangkok, Thailand)。磷酸氫二鉀購自 Fluka 公司 (Germany)。磷酸購自 Fluka 公司 (Switzerland)，氫氧化鈉購自 Sigma 公司 (Germany)。標(biāo)準(zhǔn)樣品抗壞血酸 (C)、煙酸 (B3)、泛酸鈣 (B5)、吡哆醇 (B6)、煙酸胺 (B3)、硫胺 (B)、葉酸(B9)、生物素 (B7)、氰鈷胺 (B12) 和核黃素 (B2) 購自 Aldrich 公司 (India)。

色譜參數(shù)反相液相色譜和超高液相色譜儀的色譜參數(shù)列于表 1 中。水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品維生素標(biāo)準(zhǔn)品抗壞血酸,煙酸,泛酸鈣,吡哆醇,煙酸胺,硫胺,葉酸,生物素,氰鈷胺和核黃素的配制：分別準(zhǔn)確稱量 50 mg 左右的維生素粉末，轉(zhuǎn)移到 25mL 標(biāo)準(zhǔn)容量瓶。用 Milli Q 水，定容配成 2.0 mg/mL(2000 ppm) 的貯備液。如有需要，超聲溶解。作為游離酸葉酸水溶性很差。需要將葉酸轉(zhuǎn)化成葉酸鹽，首先將標(biāo)準(zhǔn)品溶于 20 mL Milli Q 水，后滴加 0.25 M氫 氧化鈉至葉酸剛好轉(zhuǎn)化成葉酸鈉為止。然后使用 Milli Q 水配制成濃度為2.0 mg/mL 的溶液。采用相似的方法制備生物素和核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液。不用時(shí)，水溶性維生素的貯備液保存于 + 4.0 °C。取每種標(biāo)準(zhǔn)品溶液大概 200 µL 混合制成 2000 µL 水溶性維生素的添加混標(biāo)，其中每個(gè)組分濃度 200 ppm。使用 200ppm 的添加混標(biāo)和流動(dòng)相 A 稀釋配制得到不同線性濃度。

樣品制備將某一歐洲重要品牌的三個(gè)復(fù)合維生素片分別溶于 200 mL 水，超聲。加入最少量的 0.25 M NaOH 以解決某些維生素的溶解性問題。之后使用 0.25 µm 安捷倫Econofilter 注射過濾器過濾樣品溶液，用于營養(yǎng)標(biāo)注和回收率分析。

結(jié)果和討論分離和檢測用不同流動(dòng)相在不同梯度和等梯度條件下分析 添 加 混 標(biāo)。發(fā)現(xiàn)用 25 mMK2HPO4 pH 7 梯度分離得到分離度。圖 1 表示使用 Agilent Poroshell 120EC-C18，150 mm × 3.0 mm，2.7 µm 色譜柱在 20 分鐘內(nèi)就分離 10 種水溶性維生素，分離度優(yōu)異。由于這些維生素的結(jié)構(gòu)不同，因而每種維生素的譜圖和最大吸收也不同。抗壞血酸在 266 nm 有強(qiáng)吸收，而葉酸的最大吸收在 280 nm。生物素和泛酸鈣的 UV 吸收很差，因此選擇205 nm 波長用于分析。煙酸，煙酸胺和氰鈷胺的最大吸收波長在 214 nm。而吡哆醇最大吸收大約在 220 nm。硫胺分析選擇 232 nm，核黃素的分析選擇 268 nm。圖 1 是 7 個(gè)不同波長下的色譜疊加圖。可以很清楚的看到在不同采集波長下每種維生素峰高的變化。梯度運(yùn)行時(shí)基線吸收會(huì)發(fā)生變化，這是因?yàn)榱鲃?dòng)相中的緩沖液的量發(fā)生了變化。較低波長條件下這個(gè)現(xiàn)象更加明顯，這就解釋了 205 nm波長下的基線漂移。ChemStation 軟件的高級(jí)特性使其能夠查看每個(gè)峰的純度以及評(píng)估方法的特異性。本文中采用準(zhǔn)確性、線性范圍、精確性、特異性、回收率以及耐用性研究來評(píng)估這一方法。