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液質聯用儀分析蘋果汁中的殺菌劑及其代謝物
閱讀：881 發布時間：2022-8-30引言：殺菌劑是一類用于抑制真菌生長的農藥。由于食品中的殺菌劑殘留引起人們對健康問題的廣泛關注，因此歐洲、美國和其他許多國家都對其殘留進行監管。多菌靈和噻菌靈屬于苯并咪唑類殺菌劑，而抑霉唑屬于咪唑類農藥。鑒于抑霉唑很容易代謝成 α-（2,4-二氯ben基）-1H-咪唑-1-乙醇，在抑霉唑的監管上，美國要求監測其母體及其代謝物的總和。2苯并咪唑類殺菌劑廣泛應用于農業中的植物疾病控制和水果的采后處理。在美國，多菌靈（MBC）并沒有登記使用，但在很多出口水果和果汁到美國的國家中多菌靈的使用卻是合法的。另外，多菌靈是甲基硫菌靈（TM）的代謝物或降解物，后者被允許用于美國的許多農作物和草坪，這增加了人們接觸到多菌靈殘留的潛在風險。噻菌靈和抑霉唑常用于包括蘋果在內的水果的采后處理如儲藏和運輸，且這兩種化合物在美國是允許使用的。本文建立的簡單提取程序可為目標被測物提供可重現的高回收率，這歸功于安捷倫 Bond Elut Plexa 的*性能，這是一種為提高分析性能和易用性而設計的聚合物吸附劑。該吸附劑對于很多分析物均具有*的保留性能，此外，由于小粒徑的 Bond ElutPlexa 填料不易引起堵塞，所以它能為小柱提供快速而可重現的流速。Bond Elut Plexa 提取物的潔凈度降低了離子抑制效應，延長了 HPLC 色譜柱的壽命并使質譜儀器免受污染。
填充 2.7 µm 表面微粒多孔填料的安捷倫 Poroshell 120 EC-C18 色譜柱與亞 2 微米 UHPLC 色譜柱具有相似的柱效，但背壓降低了40%。液相色譜系統分析時的實際壓力不會超過 400 bar。高靈敏度的 Agilent 6460 三重四極桿液質聯用系統搭配 AJST 電噴霧離子源能為 4 個目標被測物提供低至 2 ppb 的優異檢測性能。由于它大大低于任何現有的測試要求，我們的提取方法可以用靈敏度較低的老型號質譜儀檢測，如 Agilent 6410 三重四極桿液質聯用系統。使用靈敏度比 Agilent 6460 三重四極桿液質聯用系統低的質譜檢測器時，可以考慮在萃取過程中復溶這一步對樣品進行預濃縮。之前安捷倫已經建立了蘋果汁中多菌靈與噻菌靈的檢測方法 [1]，該方法使用 Agilent Bond Elut SCX SPE 小柱凈化，采用 AgilentZORBAX Eclipse Plus C18，3.5 µm 色譜柱結合帶有可變波長檢測器的 Agilent 1200 系列液相色譜系統進行檢測。
農藥標準品購自 Sigma-Aldrich 公司（St. Louis, MO, USA）。內標（磷酸三苯酯）由安捷倫科技公司（Wilmington, DE, USA）提供。用甲醇配制成儲備液（多菌靈的濃度為 0.25 mg/mL，其他 3個被測物和內標的濃度為 1 mg/mL），并保存于–20 oC。
材料與儀器SPE: 安捷倫 Bond Elut Plexa 小柱 30 mg，3 mL（部件號 12109303）安捷倫 VacElut 20 固相萃取裝置（部件號 12234100）安捷倫活塞閥 （部件號 12234520）安捷倫硅烷化自動進樣小瓶，2 mL（部件號 5183-2072）安捷倫自動進樣小瓶的螺紋口蓋（部件號 5182-0717）LC: 安捷倫 Poroshell 120 EC-C18，2.1 x 50 mm，2.7 µm 色譜柱（部件號 699775-902）Agilent 1260 Infinity LC 系統（G1379B 微脫氣機，低延遲體積配置的 1312B 二元泵，G1367E 自動進樣器，G1330B 恒溫器）MS: 配置 AJST 電噴霧離子源的 Agilent 6460A 三重四極桿液質聯用儀
樣品制備前處理向 0.5 mL 的蘋果汁中添加 TPP（內標）使濃度為 50 ppb，建議使用 12 x 75 mm 的玻璃試管。用色譜純的水按 1:3 稀釋，渦旋，如渾濁需離心。澄清的蘋果汁無需離心。提取1. 用 0.5 mL 甲醇對 Bond Elut Plexa 小柱進行活化（先浸透再滴放）2. 直接上樣或者上清液上樣3. 淋洗 1:1 mL 水4. 淋洗 2:1 mL 30:70 的甲醇水溶液5. 真空干燥 5～10 min（10～15 in Hg）6. 用 1 mL 乙酸乙酯/異丙醇（80:20）進行洗脫。先浸泡，再將洗脫液滴至收集瓶中。待洗脫液*流出后，于柱上加低真空（2～3 in Hg）7. 洗脫液在 55 oC 條件下用氮氣流吹干8. 用 0.5 mL 初始流動相復溶（10% 甲醇、90% 水、0.1%甲酸）
LC/MS/MSLC 條件流動相 A： 0.1% 甲酸水溶液流動相 B： 0.1% 甲酸甲醇溶液進樣量： 5 µL流速： 0.5 mL/min梯度洗脫 時間（min） % B0.0 100.5 102.0 503.0 957.5 957.1 10停針時間： 7.2 min平衡時間： 2.5 min最大泵壓力： 400 bar洗針： 甲醇/水（75:25）洗針時間 10 s禁止重疊進樣無自動降低延遲體積功能MS 條件ES 離子源參數離子模式： 正離子毛細管電壓： 2800 V干燥氣流速： 12 L/min干燥氣溫度： 350 oC霧化氣壓力： 40 psi鞘氣流速： 12 L/min鞘氣溫度： 300 oC噴嘴電壓： 0 V4MS 參數掃描模式： 動態 MRM預運行腳本： SCP_MSDiverterValveToWaste(){MH_Acq_Scripts.exe}時間段#1:1.5 min 后切入 MS電子倍增管電壓： (+) 400 V
結果與討論4 種目標殺菌劑和內標（TPP）在 Bond Elut Plexa 小柱上均能得到有效的保留。Bond Elut Plexa 小柱中的吸附材料是極性增強的中性聚苯乙烯-二乙烯苯。這種吸附劑廣泛適用于非離子型酸性、中性與堿性物質的提取。我們建立了一種非常簡單的萃取方法，其中前處理是用水稀釋蘋果汁。如果蘋果汁中有大量的果肉還需要進行離心，但大多數的蘋果汁無需這一步驟。上樣和淋洗步驟靠重力流動完成。只需在洗脫前加真空干燥 SPE 柱，洗脫后加真空使洗脫步驟回收率本文建議將第二次淋洗時的甲醇濃度由 5%（通用方法）增加到30%，會顯著減少基質干擾。這使較早流出的多菌靈和噻菌靈的LC/MS/MS 靈敏度提高 30%，抑霉唑代謝物靈敏度提高 20%。抑霉唑峰面積保持不變。與 100% 甲醇相比，組合洗脫液（乙酸乙酯/異丙醇（80:20））對 4 個目標化合物的回收率略微有所提高，而疏水性強的內標（TPP）的回收率大約提高了 2 倍。表 1 列出了 4 種殺菌劑和內標的動態 MRM 轉換參數，依次為定量轉變通道和定性轉變通道。Agilent Poroshell 120 EC-C18，2.1 × 50 mm，2.7 µm 色譜柱在 5 分鐘內實現對 4 個殺菌劑和內標的分離。圖 2 是蘋果汁中添加 4 種殺菌劑（2 ppb）和內標（50 ppb）的 MRM 譜圖。所有峰的信噪比均大于 100:1。顯然，每個被測物的檢測限均能達到 ppt水平。每個樣品前 1.5 分鐘的流出液切入廢液以使離子源的污染最小。
結論本文采用固相萃取的前處理方法，結合 LC/MS/MS 檢測技術，建立了一種準確性高，重現性好的方法，該方法簡單有效。BondElut Plexa 吸附劑的性質使得該方法可以擴展應用于農藥多殘留檢測。該方法中目標被測物 5 分鐘內可以*分離，且在大多數安捷倫液相系統上都可以實現。該方法建立的 Agilent 6460 三重四極桿質譜優化參數可以被簡單的修改后用于其他的安捷倫三重四極桿液質聯用系統。當采用靈敏度較低的檢測器時可以在萃取方法中的復溶步驟進行預濃縮。