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三重四極桿氣質聯用儀統測定人尿中蛋白同化制劑
閱讀：941 發布時間：2022-8-25前言 在體育賽事中，為非法提高運動員的成績濫用藥物是世界反興feng劑機構（WADA）嚴令 禁止的。WADA 每年都要公布違禁藥物清單 [2]，并建立每個違禁藥物的允許xian量 （MRPL）[3]。清單包括了幾百種化合物，可分為 11 種不同的類別。盡管 WADA 從 1998 年成立以來付出了很大努力，但蛋白同化制劑作為一類濫用藥物，其陽性檢出率 始終維持著越來越高的趨勢。由于蛋白同化類固醇激素代謝物，無論是外源性的還是內 源性的，均有可能存在于人尿中，對這類化合物的檢測是一項艱巨的分析挑戰。 2 由于通過 WADA 認證的實驗室都被要求證明可以在 MRPL 水平 上對所有違禁藥物進行常規篩查，每個實驗室都創建了特定的 分析方法。這種反興feng劑檢測方法目前大多以兩種儀器設備為 基礎：單四極桿 GC/MS 系統和三重四極桿 LC/MS 系統。
然而，現在這個普遍采納的方案可能要發生改變。安捷倫 7000 系列三重四極桿 GC/MS 聯用系統采用 SRM 模式，可以極大地 提高違禁藥物的檢測靈敏度。應用此儀器為平臺已經建立了某 些特定類固醇（甲醇和脫氫氯甲基睪酮的代謝物）的長期檢測 方法 [4]，完成 150 種禁用藥物的復雜檢測僅需要 8 分鐘 [5]。 從實用角度出發，三重四極桿氣質聯用儀GC/MS 篩查方法必須滿足兩方面 要求： 1. 可以檢測到 GC/MS 和 LC/MS/MS 無法檢測的 MRPL 水 平的化合物，例如 2 ng/mL的 17a-甲基-5b-雄烷-3a,17b二醇（甲睪酮的代謝產物） 2. 可以在苛刻的情況下證明其穩定性 本應用介紹了使用 7000 系列三重四極桿 GC/MS 系統在 7.3 分 鐘內篩查和驗證 7 種蛋白同化制劑的檢測方法 [1]，選定的目標 物包括 17a-甲基-5b-雄烷-3a、17b-二醇以及其他蛋白同化制 劑，使用三重四極桿 GC/MS/MS 檢測這些化合物可獲得比傳 統 GC/MS 和 LC/MS/MS 更全面的信息。方法的穩定性通過兩 個星期內對西班牙第十六屆泛美運動會興feng劑控制中收集到的 1367 個樣本分析進行了驗證。
實驗 標準品和試劑 甲睪酮用作內標物，克倫特羅來自 Sigma 公司（圣路易斯市， 密蘇里州，美國），17a-甲基-5b-雄烷-3a,17b-二醇，3a-羥基 康力龍，16a-羥基呋咱甲氫龍，甲雄烯二醇，19-去甲雄酮和 19-去甲原膽烷醇酮購于 National Measurement Institute （Pymble，澳大利亞），β-葡萄糖醛酸酶制劑（E. Coli K12） 購于 Roche Diagnostics GmbH （Mannheim，德國），分析純 磷酸氫二鈉、磷酸氫鈉、甲基叔丁基醚、氫氧化鉀，碘化銨，乙 硫醇和甲醇購于 Merck 公司（Darmstadt，德國）。N-甲基-N- （三甲基硅烷基）三氟yi酰胺（MSTFA）購于 MachereyNagel （德國），超純水用 Millipore Milli-Q Integral A 10 超純 水系統制備。
儀器 本研究使用 7890 系列 GC 與 7000 系列三重四極桿質譜聯用系 統，配置分流/不分流毛細管色譜柱進樣口，使用選擇反應監測 采集模式，儀器條件列于表 1。
樣品制備 向尿樣（2.5 mL）中加入 1 mL 磷酸鹽緩沖溶液（1M，pH7）， 用 25 µL b-葡萄糖醛酸酶制劑在 55 °C 下培養 1 h。將樣品冷卻 至室溫后，加入 135 µL KOH （5M）將 pH 調節至 9.5，再加入 5 mL甲基叔丁基醚進行液-液萃取。離心后，將有機層蒸發至干， 加入 59 µL MSTFA-NH4I-乙硫醇（100:2:6,v/w/v）在 60 °C 衍 生化 30 min，轉移至進樣瓶中。
采集參數 本分析使用的安捷倫三重四極桿 GC/MS 系統參數列于表 2。
結果 方法開發 質譜條件優化過程分兩步進行。首先，采集每個化合物衍生化標 準溶液的全掃描譜圖。分別采集全掃描譜圖中的主要母離子在 5 個不同碰撞能量下的子離子質譜圖。通過這些研究確定母離子和 子離子在選擇反應監測模式（SRM）下的最佳儀器條件。 通過分析空白尿樣萃取液和基體 5 倍允許限liang（MRPL）加 標萃取液對優化結果進行最終確定。對每一個可能的母離子，都 要在 5 個不同的碰撞能量下獲取不同的子離子，包括前期實驗確 定的最佳能量值。最后確定獲得最大信噪比（S/N）而非最大絕 對響應的參數為參數，因為基體和內源性類固醇的背景噪聲 會產生顯著的影響。為了提高方法整體的定性能力，每個化合物 優化確定兩個躍遷，表 2 匯總了為每個化合物建立優化條件后的 分析結果。