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雙FID氣相色譜儀精確、高重現(xiàn)地測(cè)定血醇
閱讀：730 發(fā)布時(shí)間：2022-5-21摘要：本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)重點(diǎn)介紹了使用雙通道血醇分析儀，采用 Agilent J&W DB-ALC1 和 DB-ALC2色譜柱，通過靜態(tài)頂空 GC/FID 分析血醇濃度。雙柱/雙FID 的配置組合在測(cè)定復(fù)雜血液基質(zhì)中的酒精時(shí)能夠提供良好的精度和重現(xiàn)性。
前言頂空氣相色譜最常見和普遍的一個(gè)應(yīng)用是測(cè)定醉酒駕駛?cè)藛T血液中的乙醇含量 [1]。判斷是否酒駕的通用閾值是 0.08 g/dL，測(cè)定方法必須穩(wěn)定和經(jīng)過優(yōu)化，以確保報(bào)告值的準(zhǔn)確性。雖然酒精檢測(cè)是法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)分析項(xiàng)目，但也可能發(fā)生細(xì)微的誤差，從而改變最終的報(bào)告值。定量分析時(shí)使用內(nèi)標(biāo)法有助于抵消基質(zhì)差異 [1]。實(shí)驗(yàn)中通常選擇與乙醇性質(zhì)相似的其他醇類（如，正丙醇和叔丁醇）作為內(nèi)標(biāo)物。這些內(nèi)標(biāo)物與乙醇的化學(xué)極性相似，在血液中的基質(zhì)效應(yīng)也相同，所以選擇這些內(nèi)標(biāo)物能夠補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。與外標(biāo)法相比，使用內(nèi)標(biāo)法校正的百分比誤差更小在方法檢測(cè)限和閾值兩個(gè)濃度下均重復(fù)測(cè)定樣品，通過計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，確定方法的精度。使用正丙醇和叔丁醇做為內(nèi)標(biāo)，頂空法最高可測(cè)定 0.30 g/dL 的血醇樣品。
材料與方法使用帶分流/不分流進(jìn)樣口的 Agilent 7890B GC/FID、帶頂空控制軟件 ChemStation（B.01.04 版）的 Agilent 7697A 頂空進(jìn)樣器和用于氣相色譜系統(tǒng)的 Agilent OpenLab CDS ChemStation 軟件（C.01.05 版）進(jìn)行 GC/FID 實(shí)驗(yàn)。氣相色譜條件色譜柱： Agilent J&W DB-ALC1，30 m × 0.32 mm，1.8 µm（部件號(hào) 123-9134），DB-ALC2，30 m × 0.32 mm，1.2 µm（部件號(hào) 123-9234）載氣： 氦氣柱溫： 40 °C (4.00 min)進(jìn)樣口： 分流模式，250 °C，分流比 20:1進(jìn)樣口襯管： 超高惰性直型襯管，75 mm（部件號(hào) 5190-4048）GC/FID: Agilent 7890B GC，配置雙 FID進(jìn)樣器： Agilent 7697A 頂空進(jìn)樣器，帶 12 位樣品盤流路備件樣品瓶： 平底螺口蓋頂空樣品瓶，20 mL（部件號(hào) 5188-2753）樣品瓶蓋： 螺紋口瓶蓋和隔墊，PTFE/硅橡膠，18 mm（部件號(hào) 5188-2759，100/包）傳輸線： 去活管線，內(nèi)徑 0.53 mm（部件號(hào) 160-2535-5）三通接頭： 微板流路控制技術(shù)，兩通未吹掃分流器（部件號(hào) G3181B）隔墊： 流失性和溫度經(jīng)過優(yōu)化 (BTO) 的 11 mm 隔墊（部件號(hào) 5183-4757，50/包）分流平板： 超高惰性分流平板（部件號(hào) 5190-6145，10/包）CFT 密封圈： 可塑金屬密封圈（部件號(hào) G3188-27502，用于內(nèi)徑0.32 mm 色譜柱，10/包；部件號(hào) G3188-26503，用于內(nèi)徑 0.53 mm 管線，10/包），內(nèi)螺母（部件號(hào) GB2855-20530）進(jìn)樣口/FID： 85:15 Vespel：石墨密封圈（部件號(hào) 5062-3514，10/包）
實(shí)驗(yàn)設(shè)置的基本布局見圖 1。
樣品前處理乙醇參比標(biāo)樣購自 Restek，Bellefonte（美國賓夕法尼亞州）。標(biāo)樣的前處理步驟同樣品，即將 500 µL 各參比標(biāo)樣溶液加入 4.5 mL蒸餾水和 5 µL 經(jīng)稀釋的內(nèi)標(biāo)物中。將正丙醇或叔丁醇 (J. T. Baker) 用蒸餾水稀釋 10 倍，制為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，則最終工作理論濃度為 0.08 g/dL。向 20 mL 呃已知的消毒羊血中分別加入 5 µL 和 20 µL 乙醇（200 proof 無水乙醇，KOPTEC USP），制得 0.02 g/dL 和 0.08 g/dL 乙醇濃度已知的儲(chǔ)備血液樣品。
結(jié)果與討論圖 2 和圖 3 所示為 8 種化合物標(biāo)樣混合物通過 DB-ALC1 (FID1) 和DB-ALC2 (FID2) 獲得的分離色譜圖。在定性鑒定時(shí)，每種標(biāo)樣的保留時(shí)間都能準(zhǔn)確匹配其相應(yīng)單獨(dú)標(biāo)樣的保留時(shí)間。盡管混合物在單柱上存在多個(gè)共流出現(xiàn)象，但是我們能夠借助它們?cè)?DB-ALC1和 DB-ALC2 上的保留時(shí)間辨別它們的流出順序，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)的峰鑒定。該雙柱方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于乙醇和其他常見代謝物在兩個(gè)不同固定相上的流出順序不同。雙柱/雙 FID 方法為我們提供了額外的確認(rèn)信息，減少了干擾或其他醇類與乙醇共流出的可能。
表 1 總結(jié)了分別使用叔丁醇和正丙醇做為內(nèi)標(biāo)時(shí)，乙醇標(biāo)稱濃度分別為 0.02% 和 0.08% 的樣品重復(fù)測(cè)定 10 次的結(jié)果。總體而言，叔丁醇做為內(nèi)標(biāo)時(shí)的結(jié)果變異性大于正丙醇。使用叔丁醇作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，0.02% 和 0.08% 乙醇樣品重復(fù)測(cè)定的 % RSD 值最高可達(dá)17.08%，使用正丙醇作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，% RSD 值最高僅為 4.53%。以正丙醇做為內(nèi)標(biāo)，0.02% 和 0.08% 乙醇濃度下的 % RSD 值較一致，均低于 5%，證明該方法精度十分優(yōu)異。圖 4 和圖 5 所示為兩種內(nèi)標(biāo)法的校準(zhǔn)曲線。很明顯，以正丙醇做內(nèi)標(biāo)獲得的結(jié)果更好，因?yàn)槠錅y(cè)定值與理論值更接近。與叔丁醇內(nèi)標(biāo)相比，以正丙醇做內(nèi)標(biāo)時(shí)相對(duì)響應(yīng)系數(shù)和回歸線的斜率均更高，進(jìn)一步說明使用正丙醇做為內(nèi)標(biāo)的效果更好。叔丁醇是一種熔點(diǎn)較低（熔點(diǎn) 25 ~ 26 °C）的固態(tài)物質(zhì)，如果實(shí)驗(yàn)室溫度控制不夠理想，尤其是在冬季，則可能會(huì)帶來一些麻煩。而異丙醇的熔點(diǎn)為 -89 °C，即使溫度低于水的凝固點(diǎn)，它也仍會(huì)以液態(tài)形式存在。
結(jié)論Agilent J&W DB-ALC1，30 m × 0.32 mm，1.8 µm 和 DB-ALC2，30 m × 0.32 mm，1.2 µm 氣相色譜柱在測(cè)定復(fù)雜血液基質(zhì)中的血醇濃度時(shí)表現(xiàn)出了精度和重現(xiàn)性。分別使用正丙醇和叔丁醇做為內(nèi)標(biāo)時(shí)，結(jié)果存在顯著差異。總體而言，重復(fù)樣品檢測(cè)中使用正丙醇作為內(nèi)標(biāo)所得的結(jié)果精度更高。以正丙醇作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，0.02 g/dL 和 0.08 g/dL 濃度的重復(fù)樣品在兩根色譜柱上所得結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于等于 5%。在 DB-ALC1 和 DB-ALC2 上使用正丙醇做為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行連續(xù)校準(zhǔn)驗(yàn)證時(shí)，兩根色譜柱上的誤差均小于 6%。而使用叔丁醇做為內(nèi)標(biāo)時(shí)，連續(xù)校準(zhǔn)驗(yàn)證的誤差約為 10%。很明顯，在使用靜態(tài)頂空 GC/FID雙柱（DB-ALC1和 DB-ALC2）、雙 FID 配置分析血醇濃度時(shí)，正丙醇是理想的內(nèi)標(biāo)選擇。使用全自動(dòng)安捷倫氣相色譜頂空系統(tǒng)進(jìn)行高通量血醇分析時(shí)，采用雙柱配置、帶 CFT 分流器的分流進(jìn)樣、可塑金屬密封圈以及Agilent J&W DB-ALC1 和 DB-ALC2 色譜柱，分析周期僅為 3 分鐘，而且還能分離乙醇、內(nèi)標(biāo)以及四種潛在的干擾物質(zhì)。