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人參皂苷的 UHPLC 新方法的開發
閱讀：616 發布時間：2022-5-11摘要目的：使用帶有自動方法開發/色譜柱篩選功能的超高效液相色譜 (UHPLC) 系統對于人參皂苷類成分的適宜分離條件進行快速篩選及探索，并在此基礎上優化得到快速高效重現性良好的定性定量分析方法。方法：使用自動方法開發系統對分離條件進行篩選和優化后，得到兩種基于不同選擇性條件的最終方法，方法 1，色譜柱：Agilent Zorbax Bonus RP(3.0 x 50mm，1.8 µm)，柱溫25 °C，流動相為超純水(A)-乙腈(B)，梯度分析，流速1.0mL/min，檢測波長 203 nm；方法 2，色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（3.0 x 150 mm，1.8 µm），柱溫 50 °C，流動相為超純水 (A)-乙腈 (B)，梯度分析，流速 0.6 mL/min，檢測波長 203 nm。結果：使用上述兩個方法對標準品和樣品進行了分析，所需分析時間均小于 10 分鐘，重現性良好，保留時間 RSD < 0.2%，峰面積 RSD < 1.0%，樣品中的干擾成分與被測成分均可以得到良好分離。結論：兩種方法分析快速切分離度良好，能夠充分發揮 UHPLC 的分離能力，適合于含有人參皂苷類成分的藥材及制劑的分析。Agilent 的方法篩選軟件可以快速、無人照管地選擇最佳的色譜柱、色譜條件；使方法開發的步驟更趨系統化，更為合理。
前言人參皂苷 (Ginsenoside) 是一種固醇類化合物，三萜皂苷。主要存在于人參屬藥材中。人參皂苷被視為是此類藥材中的活性成分，具有增加白細胞數量、提高人體免疫力、促進物質代謝、抗疲勞、抗衰老等作用[1]，使用液相色譜方法分析此類成分是控制人參、三七等藥材或含此類活性成分藥品的重要手段，但是相關樣品中的人參皂苷一般需要很長的分析時間，例如：中國藥典的方法需要大概 90 至 120 分鐘時間[2]。UHPLC 技術的出現可以使液相色譜分析時間大為縮短，在不損失分離度的情況下大幅提高分析速度，目前已經廣泛應用于中藥分析領域。在分析方法的開發過程中，通過改變色譜柱的種類，柱溫等條件可以改變分離選擇性，從而對較難分離的化合物進行更好的分析，在人參皂苷的分析中，Re 及 Rg1 是一對比較難分離的成分，通常需要比較長時間（大概 20 分鐘[3]）的等度或緩梯度先把這兩個化合物分開，但是這會嚴重影響分析速度，延長分析時間。在這篇文章中，我們使用了基于 Agilent 公司的 1260 或 1290 超高效液相色譜系統的自動方法開發系統及軟件[3]對色譜柱和其他分析條件進行了自動篩選，并從中選出適合人參皂苷分析的色譜柱及相應分析條件，并在此基礎上進行改進和優化，最終得到了兩個基于不同選擇性特性的高效快速的分析方法，可分別用于不同的分析目的。通過這個研究，我們找到了人參皂苷在不同色譜柱上的色譜行為差異；同時也為類似的方法開發工作推薦一個有用的工具。
儀器試劑及色譜條件儀器和試劑Agilent 1290 Infinity 自動方法開發系統，包括：1290 色譜泵、自動進樣器、兩個柱溫箱（均配置 8 位 9 通閥）組成的柱溫箱簇、二極 管 陣 列 檢 測 器 ； ChemStation 色 譜 工 作 站 及 AgilentChemStation Method Scouting Wizard 軟件。方法開發系統及方法篩選軟件是儀器根據不同需求增加不同切換閥、柱溫箱構成。利用方法篩選軟件對多根色譜柱（最多 8 根）及多個色譜條件進行排列組合，在無人照管的情況下自動完成分析任務。方法篩選軟件能根據譜圖中色譜峰數量、分離度及保留時間等方法開發所關注的參數生成報告。Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統，配備脫氣機，四元泵，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器。Agilent 1220 Infinity 整體式液相色譜，配備脫氣機，二元泵，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器。色譜柱：Agilent Zorbax Bonus RP (3.0 x 50 mm，1.8 µm)，AgilentZorbax SB-C18（3.0 x 150 mm，1.8 µm）。以上設備，耗材及軟件均由 Agilent Technologies, Inc.（美國）生產制造。實驗所用的對照品均購買自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為HPLC 級試劑 (Sigma-Aldrich)，實驗用水由 Milli-Q 純水機（Merck-Millipore，德國）制備；所有樣品購自本地藥店。
結果及討論方法 1 的分析結果根據上述條件（方法 1）對含有三七成分的中藥成分進行了分離，五種主要人參皂苷類成分分離良好，并且不受其他干擾組分的影響