化工儀器網
技術文章
三重四極桿質譜測定食用貝類中原多甲藻酸貝類毒素
閱讀：815 發布時間：2022-5-9摘要：我們已開發了一種檢測貝類中原多甲藻酸貝類毒素的方法。該方法采用改進的 QuEChERS進行樣品前處理。使用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統結合 Agilent 6460 三重四極桿液質聯用系統完成樣品的分離和定量分析。本文研究表明，該方法操作簡便，快速可靠，可以在遠低于法規規定的限度水平下進行分離和檢測。
前言海洋生物毒素是全球食品安全關注的主要焦點之一，尤其是在沿海國家。中國的海洋食品易受海洋生物毒素的污染。近年來，由于水體的工業化和富養化，中國的內海經常發生浮游植物的大量增殖。水生物種的大規模海水養殖，尤其是占中國海水養殖產品總產量 40.7% 的貝類養殖，進一步促進了浮游植物的增殖。原多甲藻是一種浮游植物，其各種亞型在中國海域廣泛分布，一些亞型的原多甲藻能夠分泌原多甲藻酸 (AZA) 貝類毒素，這是一類海洋生物毒素，是我們重點選擇研究的一類目標化合物。這些海洋毒素的毒性很高，它們在水生物種中的生物富集、轉化和代謝，以及對來自污染水域食用貝類的消費，都可能對人類健康造成嚴重威脅。AZA 暫定的參考劑量低至 0.04 µg/kg BW [1]。當前，歐盟規定貝類中總 AZA 的最大殘留量是 160 µg/kg [2]。中國正在制定自己的海洋生物毒素監管法規，尤其是對于那些如 AZA 等急需監測的毒素。檢測 AZA 的常用方法是小白鼠生物檢定法和 LC/MS/MS 技術。然而，與小白鼠生物檢定法相比，LC/MS/MS 具有更高的選擇性、靈敏度和準確度，并且我們一般認為 LC/MS/MS 方法執行起來相對簡單、耗時短，而且還不容易產生假陰性結果。本研究的目的是采用 LC/MS/MS 建立一個簡單、快速、靈敏度高的方法，用于日常監測不同貝類如貽貝、牡蠣、蛤蚌和扇貝當中三種最常見的 AZA 毒素（AZA1、AZA2、AZA3），為中國相關標準方法的開發提供支持。
實驗部分樣品前處理按照如圖 1 所述的過程對樣品進行前處理 [3]。向樣品中加入 5 gMgSO4 和 2 g NaCl，再加入 85% 乙腈水溶液勻質并提取樣品。所得提取物采用 C18 吸附劑進行凈化，然后旋轉蒸發至近干。殘渣用 80% 乙腈水溶液復溶并依次通過濾膜過濾。采用乙腈/水梯度洗脫進行分離。然后采用正離子電噴霧離子化 (ESI+) 和多反應監測 (MRM) 檢測含有羰基和醚氧配體的 AZA（圖 2）。
結果與討論三種 AZA 的分離首先優化表 2 列出的每個化合物的 MRM 離子對參數，以實現高檢測靈敏度。使用乙腈/水流動相，其中含 0.1% 的甲酸，5 mM醋酸銨作為水相的改性劑，所得色譜圖說明這三種化合物實現了基線分離（圖 3）。
凈化吸附劑的選擇考察弗羅里硅土、C18、PSA 和 GCB 作為吸附劑凈化提取物的效果。我們發現，極性吸附劑弗羅里硅土很難從基質中吸附脂類成分，導致貝類基質中 AZA 的回收率降低。GCB 對具有平面環狀結構的化合物具有很強的吸附性，因此它會強烈吸附 AZA 并導致其回收率很低。PSA 是一種堿性吸附劑，會與 AZA 這類酸性化合物有相互作用，從而也可導致低回收率。相比而言，C18 可以有效去除脂類和碳水化合物，當然，過量使用 C18 也會降低回收率。多次試驗后發現，如果預先加入 1 g MgSO4，每 20 g 樣品再加入 1 g 凈化吸附劑 C18，即可獲得高的回收率。利用定性/定量 MRM 離子對比率確證化合物針對加標 AZA 1 µg/kg 的扇貝基質，比較了其定性 MRM 和定量MRM 離子對。如圖 5 所示，定性與定量 MRM 離子對的比率范圍是 100.4% - 104.4%，表明分析物的鑒定正確。
方法性能針對每種基質中的 AZA，分別建立了基質匹配的校準曲線。加標濃度范圍內獲得了良好的線性關系，相關系數 ≥ 0.996。每種化合物的 LOQ 測定為 1.0 µg/kg。扇貝基質的典型性能見表 4。分析AZA 加標濃度分別為 10、20 和 50 µg/kg 的混合貝類基質，表明總體回收率在 71–108% 范圍內，RSD 為 4.69–7.81%，表明方法準確度高、精密度好（表 5）。重復性、重現性和回收率我們還檢查了方法的日內和日間回收率和精密度。如表 6 所示，該方法具有良好的回收率和精密度。
真實樣品篩查檢驗了包括扇貝、貽貝、牡蠣和陸蛤等 17 個樣品。其中 7 個樣品中檢測到 AZA（表 7）。其中，三個樣品中的 AZA 濃度高于10 µg/kg，但仍低于當前規定的*濃度 160 µg/kg。
結論本文介紹了一種優化的 QuEChERS 樣品前處理和 MRM 模式下與LC/MS/MS 聯用，檢測各種貝類中三種原多甲藻酸貝類毒素的方法。所建立的方法靈敏度高，每種 AZA 的 LOQ 為 1 µg/kg。在加標濃度范圍 1–100 µg/kg 內，基質匹配的校準曲線具有良好的線性，R2 > 0.99。回收率在 71–108% 范圍內，精密度低于 10%(RSD)。方法操作簡便、快速可靠，因此可*實際樣品如藍貽貝、牡蠣、陸蛤和扇貝中 AZA 的篩選分析。
