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高效藥物清潔驗證的通用UHPLC/UV/MS 方法
閱讀：1739 發布時間：2022-4-26摘要：清潔驗證 (CV) 是藥品生產質量管理規范 (GMP) 對原料藥和藥品生產的要求。大多數藥物的清潔驗證研究通常選用配備紫外檢測器的液相色譜儀，其靈敏度水平約為 20-50 ng/mL。對于高效藥物，應用配備擴展光程流通池的紫外檢測或質譜檢測可實現靈敏度水平低至 ng/mL 的清潔驗證方法。在 Agilent 6150 系列單四極桿液質聯用系統上使用安捷倫噴射流離子源的UHPLC/MS 方法具有更高的靈敏度，其顯示出更低（約 0.5 ng/mL）的定量限 (LOQ)。此外，采用更高的進樣量可進一步降低 LOQ。本研究介紹了對濃度范圍為 0.5 ng/mL 至 1000 ng/mL 的五種模型藥物的 2 分鐘通用清潔驗證方法。該通用清潔驗證檢測方法通常可適用于許多不同的藥物，只需極少的方法開發、認證和轉換工作。本應用簡報還介紹了采用用戶補充的 NIST 質譜庫搜索程序鑒定未知化合物。
前言必須進行清潔驗證 (CV) 以證明生產鏈（容器和加工設備）的清潔度，確認活性藥物成分 (API) 已被充分去除，達到預先確定的可接受限值。開發針對高效藥物（SafeBridge 類別 3B 或 41）或具有弱發色團的藥物的高靈敏度CV 方法挑戰性。對于高效藥物而言，可接受標準通常要求檢測限低至 ng/mL 級。利用長光程 UV 流通池或質譜檢測器能夠提高傳統 LC-UV 方法的靈敏度2。此外，偶爾觀察到未知化合物，應當在 CV 研究中進行鑒定。本研究的目的是展示一種快速、靈敏、通用的 UHPLC/UV/MS 方法，用于對高效藥物進行清潔驗證，并建立一種更簡單的鑒定未知化合物的方法。配備 UV 最大光強流通池的 Agilent 1290Infinity 液相色譜系統由于光程擴展而表現出更高的信號強度。在早期研究中，使用傳統 HPLC 色譜柱所進行的清潔驗證研究表明，60 mm 最大光強流通池的靈敏度相比于標準 10 mm 流通池提高了約 2-5 倍3,4。在此研究中我們證實了采用更快速的 UHPLC 方法獲得了相似的結果。
Agilent 6150 系列單四極桿質譜儀也同樣適用于高靈敏度 CV 檢測。安捷倫噴射流離子源 (AJS) 通過使用熱鞘氣將噴霧集中防止離子源中的進一步柱外電噴霧譜帶展寬，與標準電噴霧離子源 (ESI) 相比，靈敏度提高多達 10 倍。AJS 離子源還適用于更寬的流速范圍(20–2000 µL/min)。CV 方法所用的高流速可縮短分析時間，且不影響峰容量。AJS 離子源相比于常規 ESI 源，還能夠使不同類別的化合物實現更有效的離子化。單一通用的 UHPLC/UV/MSCV 方法提高了中試規模或制造工廠的實驗室工作效率5，對快速樣品周轉提出了更高的要求。在 CV 樣品中，可能存在不同的殘留化合物，例如來自當前或之前批次的 API、副產物、降解物、賦形劑或清潔劑。借助用戶創建的質譜庫，LC/UV/MS 檢測還可鑒定色譜圖中的未知峰。Agilent OpenLab ChemStation有利于在 NIST 質譜庫搜索程序中創建附加的自定義譜庫。本應用簡報記錄了使用 Agilent PoroshellC18 色譜柱 (3.0 × 30 mm, 2.7 µm) 針對五種常見藥物開發的通用高通量UHPLC/UV/MS 方法。相比于那些全多孔顆粒填料色譜柱，這種以表面多孔顆粒填料填充的快速液相色譜柱可改善動力學性能，并且能夠在 1 mL/min流速下運行 2 分鐘。使用該程序，采用 UV 和 MS 相結合的方法能夠對濃度范圍為 0.5 ng/mL 至 1000 ng/mL 的五種模型藥物的混合物進行測量。對此方法的方法性能（例如特異性、精密度、準確度、檢測限 (LOD)、定量限(LOQ) 和線性）進行測定，結果發現其能夠滿足預期用途要求。還展示了自定義質譜庫的創建及其搜索功能。該方法可能適用于各種藥物的 CV，且所需的方法開發、認證和轉換工作極少。
實驗部分開發出一種通用的 LC-UV/MS 方法并應用于五種模型藥物：磺胺甲二唑、磺胺甲惡唑、心得安、丙咪嗪。盡管這些藥物并不具有很高的藥效，但是選擇它們足以說明方法性能和系統功能。本文還展示了采用標準流通池和擴展光程 UV 流通池以及 MS-SIM/SCAN 模式對上述藥物進行分析所獲得的各種濃度下的線性。本研究還使用大體積進樣對磺胺甲惡唑的信噪比 (S/N) 的改善程度進行了探究。表 1 顯示了所開發的通用方法的儀器參數詳情。
試劑與材料使用的所有溶劑和添加劑均為 LC/MS級，購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis,MO, USA)。純水來自 Millipore 公司的Millipore Milli-Q 水純化系統 (Billerica,MA, USA)。標樣的前處理在甲醇中配制濃度為 1000 µg/mL的磺胺甲二唑、磺胺甲惡唑、心得安、丙咪嗪儲備液。使用50:50 [甲醇:流動相 A (MPA)] 將儲備液稀釋為 10 µg/mL 的工作溶液。通過連續稀釋配制各種濃度的線性溶液。濃度 (ng/mL) 分別為：0.2、0.3、0.5、1、5、10、20、30、50、100、500、1000、2000、5000 和 10000。
結果與討論UHPLC/UV 檢測在該通用 UHPLC/UV 方法中使用配備高靈敏度最大光強 60 mm 流通池或標準 10 mm 流通池的 Agilent 1290 Infinity二極管陣列檢測器（表 1）。在使用10 mm 流通池的情況下，將五種化合物的混合物重復進樣六次所獲得的色譜圖進行疊加（圖 1）。使用兩種流通池進行濃度最高為 10000 ng/mL 的線性實驗。就磺胺甲二唑而言，使用高靈敏度流通池和標準流通池分別得到5 ng/mL 和 20 ng/mL 的 LOQ。正如預料，采用高靈敏度流通池得到的檢測限比采用 10 mm 流通池得到的檢測限低 3-4 倍。這些結果與早期研究相差無幾2。采用兩種流通池得到的 LOD/LOQ 濃度范圍如表 2 所示。使用 UV 檢測器和標準流通池可獲得 20-50 ng/mL的 LOQ。在該線性范圍研究中，處于實驗濃度水平的化合物的線性表明相關系數 R2 > 0.99（圖 2）。
發現 LOQ 下的峰面積和保留時間的RSD 分別小于 5% 和 0.1%（表 3）。實驗濃度下所有化合物的線性均表現出線性相關系數或 R2 > 0.98（圖 4）。采用 1/x 的加權因子2 由線性方程推算出的準確度值處于 15% 以內（表 4）。還將單離子監測 (SIM) 方法所獲得的LOQ 同 MS 掃描數據進行了比較，其中 SIM 和全掃描數據在同一次運行中進行采集。來自全掃描數據的化合物提取離子色譜圖 (EIC) 的 LOQ 對于所有化合物均為 5 ng/mL（數據未示出），表明 SIM 模式的靈敏度比全掃描模式高大約 10 倍。用于 LC/MS 運行的大體積進樣研究了在高靈敏度 CV 方法中使用大體積進樣獲得更低 LOQ 的可能性。這對于需要更高靈敏度的情況十分有用。大體積進樣可提高峰面積和 S/N，但是可能增加譜峰展寬。這可能并非 CV測定中主要關心的問題，因為在實際CV 樣品溶液中很少觀察到與多種 API相關的峰。使用該通用方法獲得的三種不同濃度的磺胺甲惡唑的大體積進樣結果如表 5 所示。結果表明，在30 mm 色譜柱上，當進樣量由 5 µL 增加至 12 µL 時，峰面積、峰寬和 S/N分別提高了 57%、31% 和 41%?；前芳讗哼蜓芯勘砻?，采用更高體積的進樣 (10 µL) 能夠使靈敏度再提高 2 倍。在本研究所用的 3 mm 色譜柱上，采用 12 µL 以上的大體積進樣將導致譜峰分裂。
結論高效藥物的 CV 需要采用高靈敏度和高通量方法。本研究開發出了一種用于 CV 的 2 分鐘通用方法，并采用五種常見藥物對其進行了驗證，結果展示了該方法在此應用中的性能。使用UV 和 MS (SIM) 檢測分別可獲得 20-50 ng/mL 和 0.5 ng/mL 的 LOQ。使用最大光強 UV 流通池和大體積進樣可進一步改善該方法，其靈敏度可分別提高 2-4 倍和 2 倍（使用 10 µL 的進樣量）。Agilent 1290 Infinity UHPLC與配備安捷倫噴射流離子源 (AJS) 的Agilent 6150 單四極桿質譜儀在 SIM 或SCAN 模式下運行，為 CV 研究提供了一種通用的工具，適用于對來自生產設備的沖洗溶液進行定量分析。此外，通過搜索用戶補充的質譜庫可輕松鑒定未知化合物。