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大家都了解液質聯用技術對膠類藥材進行鑒定
閱讀：1186 發布時間：2022-1-19摘要：本文基于 2015 年版《中國藥典》[1] 中采用液質聯用技術分析膠類藥材的定性方法，開 發了穩定、快速、靈敏的三重四極桿液質聯用 法和四極桿飛行時間液質聯用 (LC/Q-TOF) 法進行阿膠、鹿角膠、龜甲膠的定性鑒別；同時，利用 Q-TOF 強大的化合物 定性能力，結合蛋白質庫，建立了特征肽段序列分析方法以及“假藥”的初步定性方法。
前言：膠類藥材是我國傳統中藥中一類特殊的動物藥，是由動物的皮、骨骼等經特殊工藝加工 而成，常見的有阿膠、鹿角膠、龜甲膠及其相關中成藥制劑。近年來，隨著膠類藥用量 增長，原料資源供不應求，新聞曝光了一些不法生產企業為降低成本，采用其它動物雜 皮投料，給消費者的健康帶來嚴重隱患。為了保障公眾用藥安全有效，2015 年版《中國 藥典》[1] 制訂了符合膠類藥材特點的定性方法：采用液質聯用技術，分析阿膠、鹿角膠、 龜甲膠的特征肽段，方法專屬性強、科學可靠。 安捷倫科技公司針對這一變化開發了穩定、快速、靈敏的三重四極桿液質聯用法，進行阿膠、鹿角膠、龜甲膠的定性鑒別。同時，鑒于很多實驗室有高分辨質譜測試 需求，我們在藥典 液質聯用方法的基礎上，開發了四極桿飛行時間液質聯用 (LC/Q-TOF) 法。此外，利用 Q-TOF 強大的化合物定性能力，結合蛋白質庫，建立了特征肽段序列分 析方法以及“假藥”的初步定性方法。
實驗部分：試劑和樣品材料 實驗用色譜純乙腈購自 Merck，色譜純甲酸購自 Dikma，超純 水為 Milli-Q 系統制備，碳酸氫銨購自 ACROS，胰蛋白酶購自 Promega。樣品材料為市售阿膠、鹿角膠、龜甲膠。 儀器 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色譜 Agilent 6460C 三重四極桿質譜儀 Agilent 6530 四極桿飛行時間質譜儀
樣品制備 取樣品粉末 0.01 g，加 1% 碳酸氫銨溶液 5 mL，超聲處理 30 分 鐘后，用 0.22 uM 微孔濾膜過濾，取續濾液 100 μL 置微量進樣瓶 中，加胰蛋白酶溶液 10 μL（采用序列分析用胰蛋白酶，加 1% 碳 酸氫銨溶液制成每 1 mL 中含 1 mg 胰蛋白酶的溶液，臨用時配制）， 搖勻，37 °C 恒溫酶解 12 小時。
色譜條件 色譜柱： Eclipse Plus C18（2.1 x 100 mm，1.8 μm） 柱溫： 40 °C 進樣體積： 5 µL 流速： 0.3 mL/min 流動相： A：H2O 含 0.1% 甲酸；B：乙腈 梯度洗脫： 0 min 5%B；25 min 20%B；40 min 50%B 三重四極桿串聯質譜條件 質譜系統： Agilent 6460C 離子源： 配備安捷倫噴射流的 ESI 模式： 正離子 霧化氣： N2 霧化氣壓力： 30.0 psi 干燥氣溫度： 325 °C 干燥氣流量： 8.0 L/min 毛細管電壓： 3500 V 鞘氣溫度： 350 °C 鞘氣流量： 12.0 L/min 噴嘴電壓： 0 V Delta EMV： 0 V 掃描模式： MRM 表 1 中列出了與待測物相關的 MS MRM 參數
四極桿飛行時間質譜條件 質譜系統： Agilent 6530 離子源： 配備安捷倫噴射流的 ESI 模式： 正離子 霧化氣： N2 霧化氣壓力： 30.0 psi 干燥氣溫度： 325 °C 干燥氣流量： 8.0 L/min 毛細管電壓： 3500 V 鞘氣溫度： 350 °C 鞘氣流量： 12.0 L/min 噴嘴電壓： 0 V 掃描速度： 3 譜圖/秒 掃描模式： 鑒定采用 Target MS/MS， 未知肽段定性采用 Auto MS/MS 表 2 中列出了與待測物相關的目標質量數
結果與討論 基于 2015 年版《中國藥典》開發的 液質聯用法分析膠類藥材，重現性好、靈敏度高。阿膠、鹿角膠、龜甲膠各 MRM 通道信噪比均大于 500，其中龜甲膠的 631.3→546.4 通道信噪比大于 77000（如圖 1 所示），能夠滿足 2015 年版 《中國藥典》信噪比大于 3:1 的要求。
采用 LC/Q-TOF 法分析膠類藥物時，利用 Target MS/MS 模式采集數據，運用高分辨 EIC 碎片離子提取技術進 行數據處理，可以獲得與液質聯用法一致的定性結果。阿膠、鹿角膠、龜甲膠各特征離子信噪比均大于 200，同 樣滿足 2015 年版《中國藥典》信噪比大于 3:1 的要求。圖 2 為采用 LC/Q-TOF 法分析龜甲膠所得特征碎片 離子色譜圖。
此外，Q-TOF 可以提供可靠的 MS 和 MS/MS 數據，其具有強大的化合物定性能力，結合蛋白質庫，可以進行特 征肽段的序列分析。圖 4 和圖 5 展示了阿膠中上述特征肽段 m/z 618.3 二級質譜圖及其序列分析結果。該特征 肽段位于驢的 I 型膠原蛋白 α2 鏈上第 692 – 706 位置上，氨基酸序列為 G-E-A-G-A-A-G-P-A-G-P-A-G-P-R。
結論 分別采用 Agilent 6400 系列液質聯用和 6500 系列 Q-TOF 液質聯用 系統，針對 2015 版藥典收載的阿膠、龜甲膠、鹿角膠三種膠類 藥材進行定性方法開發，結果表明，阿膠、龜甲膠、鹿角膠的信 噪比遠遠優于藥典的要求。在此基礎上，開發了膠類藥品的專屬 性肽段鑒別方法以及特征肽段序列分析方法，并將特征肽段分析 成功應用于一例“假龜甲膠”的鑒別中