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使用安捷倫二維液相色譜解決方案進行在線脫鹽和離子對反相液相色譜分析
閱讀：1906 發布時間：2021-11-8摘要：由亞磷酰胺化學法合成的寡核苷酸通常使用離子對反相液相色譜 (IP-RPLC) 和陰離 子交換色譜進行分析和純化。在 IP-RPLC 分析中，陰離子交換純化餾分的高含鹽量 會削弱寡核苷酸參與離子配對的能力。這就需要在 IP-RPLC 分析之前對樣品進行脫 鹽，這一步驟通常使用離心過濾器手動完成。 本應用簡報展示了高鹽濃度溶液中寡核苷酸的直接二維液相色譜分析：在第一維 ( 1 D) 中進行在線脫鹽，隨后在第二維 (2 D) 中進行 IP-RPLC 分析。在該設置中，二維 液相色譜的使用提高了工作流程速度，同時避免了手動的樣品前處理過程。
前言：在分子生物學和分子診斷中，聚合酶鏈式 反應 (PCR)、基因沉默以及相關技術1 都 需要標準的和經修飾的合成寡核苷酸。此 外，合成寡核苷酸在作為治療劑治療各種 疾病（例如癌癥和病毒性疾病）方面的重 要性日益突顯2 。寡核苷酸類藥物包括反 義寡核苷酸、小干擾 RNA (siRNA) 和適 配體。反義寡核苷酸和 siRNA 均通過阻 止 mRNA 翻譯從而阻止蛋白質合成。適 配體通過形成適配體-蛋白質復合物，從 而抑制蛋白質的生物學功能3 。 寡核苷酸通常通過亞磷酰胺化學法合成2,4。 可獲得的純度通常大于 70%，合成后存 在的常見雜質包括缺失或增加序列的寡核 苷酸連同未*去保護的產物、缺失嘌呤 堿基的寡核苷酸以及其他降解產物2 。通 常使用離子對反相液相色譜 (IP-RPLC) 和 陰離子交換色譜對合成的去保護寡核苷酸 進行分析分離與純化2,4。陰離子交換純化餾分通常含有高濃度的 鹽，如氯化鈉 (NaCl) 或溴化鈉 (NaBr)。 當使用 IP-RPLC 對這些餾分進行分析時， 高濃度的鹽會削弱寡核苷酸參與離子配對 的能力，從而導致保留時間變化、峰分裂 以及峰流穿5 。為了對陰離子交換純化餾 分進行成功的 IP-RPLC 分析，需要在分 析前對樣品進行脫鹽5 ，而這一過程通常 手動完成。 本應用簡報展示了高鹽濃度溶液中寡核苷 酸的直接二維液相色譜分析，這一鹽濃度 與寡核苷酸合成后陰離子交換純化餾分中 的鹽濃度相當。二維液相色譜分析的第一 維用于在線脫鹽，隨后在第二維中進行 IP-RPLC 分析。在該設置中，二維液相色 譜的使用可以節省時間并避免手動的樣品 前處理步驟。省去手動樣品前處理步驟可 以提高重現性，且可以避免樣品前處理過 程中的樣品損失。
實驗部分 設備 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜系統 包括以下模塊： • 兩臺 Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配備冷卻裝置（選件 #100） • 兩臺 Agilent 1290 Infinity II 高容量柱 溫箱 (G7116B) • 兩臺 Agilent 1290 Infinity II 二極管陣 列檢測器 (G7117B)，配備 10 mm 最 大光強卡套式流通池 (G4212-60008) • Agilent 1290 Infinity 閥驅動 (G1170A)，帶二維液相色譜閥、 主動溶劑調制 (G4243A) • 兩個 Agilent 1290 Infinity 閥驅動 (G1170A)，配備帶 40 µL 定量環的 多中心切割閥 (G4242-64000) 軟件 Agilent OpenLab CDS ChemStation 版， 版本 C.01.08 [210] 以及二維液相色譜軟 件，版本 A.01.04 SR1。 色譜柱 • Agilent PLRP-S 100 ?, 2.1 × 50 mm, 3 µm（部件號 PL1912-1300） • Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色譜 柱，2.1 × 50 mm, 2.7 µm（部件號 659750-702）
化學品 所有試劑純度均為液相色譜級。甲醇購 自 Merck (Darmstadt, Germany)。新制超 純水來自配置 0.22 µm 膜式終端過濾器 (Millipak) 的 Milli-Q 超純實驗室水純化系統 (Millipore, Merck (Darmstadt, Germany))。 乙酸銨和六氟異丙醇 (HFIP) 購自 Merck (Darmstadt, Germany)。三乙胺 (TEA) 和 氨水分別購自 Fluka (Steinheim, Germany) 和 VWR (Darmstadt, Germany)。 樣品與樣品前處理 將寡核苷酸分離度標準品、RNA 和 DNA 樣品溶于水。得到的儲備液用水或 2 mol/L NaCl 溶液按 1:1 進一步稀釋，使水或 1 mol/L NaCl 溶液中具有相同濃度的寡核 苷酸。1 mol/L NaCl 的寡核苷酸溶液用 于模擬具有高鹽濃度的陰離子交換純化 餾分。 使用 Microcon YM-3 離心過濾器以及 3 kDa NMWCO (Millipore, Merck (Darmstadt, Germany)）按以下步驟對 1 mol/L NaCl 的寡核苷酸溶液進行手動 脫鹽： • 將 1 mol/L NaCl 的寡核苷酸溶液 (200 µL) 轉移到樣品儲液槽，14000 g 離心 30 分鐘，以濃縮寡核苷酸并洗 脫鹽分 • 將 200 µL 水轉移到樣品儲液槽， 14000 g 離心 30 分鐘以進行清洗• 將樣品儲液槽顛倒放入一個干凈的樣 品瓶，1000 g 離心 3 分鐘，以使濃 縮物轉移到樣品瓶中 • 用水將濃縮物復溶，最終體積約為 200 µL
寡核苷酸分離度標準品（部件號 5190-9028）： 14 mer：rCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU 17 mer：rUrCrArCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU 20 mer：rUrCrArUrCrArCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU 21 mer：rGrUrCrArUrCrArCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU RNA 樣品（RNA/2’-OMethyl 混合；安捷倫 NSAD 合成）： 5’-GuGcCaAcCuGaUgCaGcU-3’，大寫字母：RNA，小寫字母：OMethyl DNA 樣品（*硫醇化；安捷倫 NSAD 合成）： 5’-ugcaCCCTGGATACCauuu-3’，大寫字母：DNA，小寫字母：OMethyl
結果與討論 圖 1 展示了水（圖 1A）和 1 mol/L NaCl 溶液（圖 1B）中寡核苷酸分離度標準品 的一維 IP-RPLC 分析。圖 1B 清楚地顯示 注入的寡核苷酸溶液中的高濃度鹽會削弱 其參與離子配對的能力，從而導致峰分裂 以及峰流穿（可看見較大的進樣峰）。 從圖 2 經脫鹽的寡核苷酸溶液的 IP-RPLC 分析可以看出，用離心過濾器對 1 mol/L NaCl 的寡核苷酸分離度標準品溶液進行 手動脫鹽后可避免峰分裂以及峰流穿。然 而，使用離心過濾器進行手動脫鹽是一個 費時費力的過程，通常耗費約 75 分鐘。 此外，手動脫鹽后單個寡核苷酸的強度比 發生了變化，這很可能是由較小的寡核苷 酸部分損失所致。 使用配備主動溶劑調制的 1290 Infinity II 二維液相色譜系統的中心切割二維液相色 譜可實現高鹽濃度溶液中寡核苷酸的直接 分析。二維液相色譜分析的第一維用于 在線脫鹽，隨后在第二維中進行 IP-RPLC 分析。