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使用Captiva 和 LC/MS/MS 分析嬰兒配方奶中的真菌毒素
閱讀：594 發布時間：2021-10-24摘要：多個國家規定了食品中真菌毒素的含量限值。然而，某些食品中含有復雜的蛋白質 和脂質，為準確定量分析這些基質中的低濃度真菌毒素帶來了很大的挑戰。本應用 簡報介紹了采用快速、簡便、經濟、高效、耐用和安全 (QuEChERS) 的工作流程和 Agilent Captiva EMR-Lipid 過濾柱凈化測定固態和液態嬰兒配方奶中的 13 種真菌毒 素。由于 Captiva EMR-Lipid 吸附劑的高選擇性，所有真菌毒素均獲得了出色的回收 率 (70.4%–106.8%) 和精密度 (RSD < 18%)。這一簡單而穩定的方法僅需極少設備和 專業技術，因此可輕松應用于食品實驗室。
前言：真菌毒素是谷物、玉米和堅果等多種農作物上真菌物種的次級 代謝物。當奶牛食用了受污染的飼料后，真菌毒素及其代謝 物會分泌到牛奶中1 。黃曲霉毒素 M1 是牛奶中最常見的真菌 毒素，許多國家/地區都對其進行了監測和監管，包括美國和 歐洲國家2,3。盡管還沒有針對牛奶中其他真菌毒素的法規，但 對其他真菌毒素（如伏馬菌素和赭曲霉毒素）的監測也日漸 增多。 由于法規限值非常低，尤其是在嬰兒配方奶中，因此，為去除 基質干擾以增強低濃度分析物的信號，樣品前處理不可少。 免疫分析或 LC/MS 方法，結合樣品前處理技術（如免疫親 和、固相萃取 (SPE) 或穩定同位素稀釋4 ）可用于分析真菌毒 素。但是，復雜的多脂樣品由于基質組分（如蛋白質和脂質） 濃度較高，其分析尤為棘手。免疫親和柱價格昂貴，且只能用 于特定的分析物、化合物類別或樣品類型。其他凈化產品可能 缺乏對目標分析物的選擇性，無法有效去除脂質，從而導致分 析重現性差、基質效應明顯，并使基質在儀器中聚集。 Agilent Captiva EMR-Lipid 是一款脂質去除產品，結合了體積 排阻與疏水相互作用兩種凈化機制，能夠選擇性地捕獲脂類 烴鏈，同時不損失目標分析物。Captiva EMR-Lipid 凈化管現 有 3 mL 和 6 mL 兩種體積，可提供一種簡單的流通式凈化， 能夠從多脂樣品萃取物中選擇性地去除脂質，適用于多類別、 多殘留分析。使用 QuEChERS 萃取從液態嬰兒配方奶和嬰兒 配方奶粉中萃取 13 種真菌毒素。QuEChERS 方法因其能夠高 效萃取多個類別的分析物而著稱，但該方法同時也會萃取出大 量基質。Captiva EMR-Lipid 過濾柱具有高脂質去除率，有助 于分析人員準確定量目標真菌毒素。此外，通過分析嬰兒配方 奶樣品中三種加標濃度下的黃曲霉毒素（AF-B1、B2、G1、 G2 和 M1）、赭曲霉毒素（OTA 和 OTB）、伏馬菌素（FB1、 FB2 和 FB3）、玉米赤霉烯酮 (ZON)、霉酚酸 (MPA) 和雜色曲 霉素 (STC) 對該方法進行了驗證。對于這類復雜脂肪基質中痕 量真菌毒素的分析，該方法表現出了優異的回收率、精密度和 靈敏度。
實驗部分 樣品前處理 • Captiva EMR-Lipid 3 mL 凈化管（部件號 5190-1003） • Captiva EMR-Lipid 6 mL 凈化管（部件號 5190-1004） • QuEChERS Original 萃取鹽（部件號 5982-5555） • VacElut SPS 24 位真空萃取裝置（部件號 12234022）
化學品與試劑 從當地雜貨店購買食品樣品用于方法定量和基質去除研究。標 準品和內標以預混合溶液的形式購自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 或 Romer Labs (Getzersdorf, Austria)。LC 溶劑購自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。 驗證研究 通過分批分析驗證嬰兒配方奶中的真菌毒素，包括兩個雙空白 樣品、兩個空白樣品、六個校準品和三種 QC 濃度。QC 樣品 的預加標濃度如表 1 所示，每個樣品重復六次 (n = 6)，并在 兩組校準曲線之間進樣。使用六種濃度的校準品繪制校準曲 線，如下所示： • 對于 AF-B1、AF-B2、AF-G1、AF-G2、MPA、OTA、STC 和 ZON，采用 0.25、1、5、10、20、40 ng/mL • 對于 AF-M1 和 OTB，采用 0.125、0.5、2.5、5、10、 20 ng/mL • 對于 FB1、FB2 和 FB3，采用 1.25、5、25、50、100、 200 ng/mL 同位素標記內標 13C17-AF-B1 的加標濃度為 5 ng/mL。
樣品前處理的詳細步驟 對于嬰兒配方奶粉 (5 g)，向校準品和 QC 樣品中預加標適當 濃度的目標分析物，萃取之前，使其*浸入至少 1 小時。 接下來加入 10 mL 水，使其浸入樣品中。對于液態嬰兒配方 奶，使用 10 g 樣品進行萃取，并相應地對校準品和 QC 樣品 預加標，無需再加水。對于嬰兒配方奶粉和液態嬰兒配方奶， 加入 10 mL 乙腈（含 2% 甲酸）和 QuEChERS 萃取鹽（4 g MgSO4，1.5 g NaCl），在 Geno/Grinder 上垂直振蕩 10 分鐘以 萃取樣品。然后在 5000 rpm 下離心 5 分鐘。移取上層乙腈相 (8 mL) 至潔凈的 15 mL 試管中，加入 2 mL 水進行稀釋（水 的體積百分比為 20%）并渦旋混合。將萃取物 (2.5 mL) 上樣 到 3 mL Captiva EMR-Lipid 凈化管，使其在重力作用下流過凈 化管。待萃取物*從 Captiva EMR-Lipid 凈化管中洗脫之后 （約 10 分鐘），施加真空，將真空度從 1 增加到 10 英寸汞柱 以排空凈化管。對于預加標樣品，將 0.500 mL 洗脫液轉移到 自動進樣器管中，加入 0.300 mL 含 0.1% 甲酸的 5 mmol/L 甲 酸銨。將 0.500 mL 空白洗脫液轉移至自動進樣器管中，加入 0.270 mL 含 0.1% 甲酸的 5 mmol/L 甲酸銨和 0.030 mL 適當 的工作標準溶液，來配制基質匹配的校準物。
結果與討論 線性 使用 Agilent MassHunter 定量分析軟件處理數據。使用線性回 歸擬合和 1/x2 加權得到 13 種真菌毒素的校準曲線，其 R2 值均 在 0.992–0.998 之間。所有校準品的準確度都在預期值 ±10% 以內。 準確度和精密度結果 本研究獲得了出色的結果，結果匯總如表 2 所示。所有 QC 樣 品的回收率都在 70%–120% 范圍內，所有濃度下的 %RSD 均 小于 20，其中大多數分析物的 %RSD 小于 10。由于乙腈對伏 馬菌素的萃取能力較差，伏馬菌素成為了本研究中一類具 有挑戰性的真菌毒素。優化實驗表明，加入 2% 甲酸可大幅提 高該類分析物的溶解度，且不會對其他類別的分析物產生不利 影響。 EMR-Lipid 機制 EMR-Lipid 的選擇性得益于體積排阻和疏水相互作用兩種機制 的結合。脂類具有線性、無支鏈的烴鏈，其分子足夠小，可以 進入 EMR-Lipid 吸附劑中。一旦進入吸附劑中，脂類就會因疏 水相互作用而被牢牢捕獲。大多數分析物都不含線性、無支鏈 的烴鏈結構，因此不會進入吸附劑中，而是留在溶液中以待分 析。較短的烴鏈（少于六個碳原子）與 EMR-Lipid 的結合不夠 強，因此無法像烴鏈較長的脂類那樣得到有效去除。EMR-Lipid *的凈化機制以基質干擾物而不是各種類別的分析物為捕集 目標，非常適用于多類別、多殘留分析。
競爭產品比較 ― 回收率和精密度 對 Captiva EMR-Lipid（6 mL 小柱）和市售直通式凈化產品 （競爭產品 A，6 mL，500 mg）的回收率和精密度進行評估。 在此次評估過程中，直接對嬰兒配方奶萃取物進行加標，以排 除萃取過程對回收率和精密度的影響。表 3 中匯總的評估結果 表明，使用 Captiva EMR-Lipid 的回收率更高，尤其是對于玉 米赤霉烯酮、赭曲霉毒素 A 和雜色曲霉素。Captiva EMR-Lipid *的吸附劑化學機制能夠選擇性地捕獲脂質，而目前的市售 產品往往會將不需要的分析物保留下來（尤其是具有較強疏水 性的分析物）。 使用氣質聯用儀GC/MS監測基質去除率 盡管已經使用 LC/MS 完成了驗證，但通過比較樣品凈化產物 的 GC/MS 全掃描結果仍可獲取有關基質和脂質去除情況的重 要信息。圖 1 所示為嬰兒配方奶在 Captiva EMR-Lipid 凈化前 后的 GC/MS 全掃描色譜圖。黑線為未凈化樣品的色譜圖，表 明存在脂質及其他基質共萃取物。Captiva EMR-Lipid 凈化后 的液態嬰兒配方奶（紫線）的去除率為 90%（根據公式 1 計 算得到）。晚洗脫基質被*去除，早洗脫基質顯著減少但未 *去除。
結論 本研究證明 Captiva EMR-Lipid 是一種簡便有效的凈化方法， 適用于多種真菌毒素的分析。嬰兒配方奶的驗證結果表明方法 具有優異的回收率（70.4%–106.8%）和精密度 (RSD < 18%)， 且靈敏度可達 1.0 ng/g。GC/MS 全掃描結果表明該方法可實 現高效凈化。產品比較結果表明，使用 Captiva EMR-Lipid 的 真菌毒素回收率遠優于其他市售凈化產品。該方法在多種應用 中都具有較高的基質脂質去除率以及分析物回收率，但其中一 些應用不在本研究的范圍之內5,6。Captiva EMR-Lipid 代表了用 于多類別、多殘留分析的新一代選擇性脂質凈化產品，對于需 要簡化樣品前處理并改善方法性能的實驗室而言，該產品是理 想之選。