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Agilent 1290生物液相色譜系統進行高分離度 SEC 分析
閱讀：987 發布時間：2021-8-24摘要：本應用簡報介紹了配備 Agilent AdvanceBio SEC 色譜柱和超低擴散毛細管的 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統通過體積排阻色譜 (SEC) 分離蛋白質的出色分離 度。生物兼容性 UHPLC 系統能夠使用腐蝕性鹽緩沖液進行分析，因此節省了維護 費用。比較了不同內徑毛細管（0.17、0.12 和 0.07 mm）在 SEC 分析中的分離度。 對一種蛋白質混標和單克隆抗體 (mAbs)（包括聚集體）進行了分離，并比較了分離 度。此外，由單一軟件解決方案中的 Agilent OpenLab GPC/SEC 附加軟件確定了分 子量，實現了一步式工作流程。
前言：mAbs 等現代生物藥物是高度異質性的化 合物。聚集體是最重要的關鍵質量屬性 (CQAs) 之一，通常采用 SEC 進行監測。 這項技術可根據標準品計算待測物分子 量，從而對化合物進行鑒定。此外，該技 術還可通過顯示更高分子量的聚集體成分 （如二聚體和更高程度聚集體）來確認純 度。為獲得足夠的分離度，推薦使用亞 2 µm 顆粒填充的現代 SEC 色譜柱。為 實現最佳性能，亞 2 µm 色譜柱和死 體積盡可能小的 UHPLC 儀器。死體積過 大會因擴散效應而損失這些色譜柱獲得 的分離度。此外，*生物兼容的 1290 Infinity II 生物液相色譜系統可以應對 SEC 緩沖液中常用的高濃度鹽，以維護成本提供可靠結果。 本應用簡報介紹了現代亞 2 µm SEC 色譜 柱在 1290 Infinity II 生物液相色譜系統上 的應用，展示了使用死體積極小的儀器帶 來的優勢。為證明死體積對蛋白質和聚集 體分離的影響，使用了不同內徑的毛細 管。將特征明確的 NISTmAb 通過 pH 誘 導和熱誘導產
實驗部分 儀器 • Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵 (G7132A) • Agilent 1290 Infinity II 生物 Multisampler (G7137A)，配備集成 式樣品恒溫箱（選件 #101） • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B)，配備生物兼容性熱交換器 • Agilent 1290 Infinity II 可變波長檢測器 (G7114B)，配備生物兼容性微量流通 池，3 mm，2 µL 其他部件 Agilent 1290 Infinity II 生物超低擴散工具 包 (G7132A#006) 軟件 Agilent OpenLab 2.5 版和 GPC/SEC 附加 軟件 1.2 版
色譜柱 Agilent AdvanceBio SEC 200 ?, 4.6 × 300 mm, 1.9 µm （部件號 PL1580-5201） 樣品 • 校準用蛋白質混標（部件號 5190- 9417）：甲狀腺球蛋白 (670000 Da)、 γ-球蛋白 (150000 Da)、卵清蛋白 (45000 Da)、肌紅蛋白 (17000 Da)、 血管緊張素 II (1000 Da) • 人源化單克隆抗體 (mAb) 曲妥珠單 抗（商品名為赫賽汀）購自 Roche (Basel, Switzerland)。曲妥珠單抗溶于 30 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中，pH 6.8 • Agilent NISTmAb，人源化 IgG1κ mAb （部件號 5191-5745）
pH 誘導/溫度誘導 NISTmAb 方案 使用流動相將 mAb 稀釋至 2 mg/mL 的最 終濃度。pH 誘導方法與其他文獻所述基 本相同，僅有略微改動[1]：將 1 mol/L HCl 溶液緩緩滴加到樣品溶液中，使其 pH 值 從 6.0 改變為 1.0。然后，滴加 1 mol/L NaOH 溶液將 pH 值調節至 10.0。最后， 再次滴加 1 mol/L HCl 溶液將 pH 值調回 6.0。pH 值變化間大約有 1 分鐘的等待時 間，期間持續緩慢攪拌溶液。將所得溶液 在 60 °C 下溫育 60 分鐘。 溶劑和化學品 • PBS：在 25 °C 下將 1 片 PBS 片溶于 200 mL 去離子水，得到 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液、0.0027 mol/L 氯hua鉀、0.137 mol/L 氯化鈉，pH 7.4 • 化學品購自德國 VWR 公司 • 新制超純水產自配置 LC-Pak Polisher 和 0.22 µm 膜式終端過濾器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化系統
結果與討論 用于蛋白質 SEC 分離的現代色譜柱中填 充亞 2 µm 顆粒，可實現最佳分離。而這 需要儀器具有優化的低死體積，因為高死 體積特別是內徑較大的毛細管會損失獲得 的分離度。1290 Infinity II 生物液相色譜 系統對 5 種蛋白質混標（包括 3 種二聚 體）的分離結果如圖 1A 所示。為了降低死體積和擴散效應，我們使用了 內徑 0.07 mm 的毛細管進行分離。早洗 脫的甲狀腺球蛋白二聚體 (4.947 min) 實 現了部分分離。如需設置用于分子量測定 的校準，使用該混合物中的所有蛋白質生 成校準曲線（圖 1B）。獲得了四階最佳曲 線擬合。
