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Agilent 6470分析食品中農(nóng)藥殘留的全面LC/MS流程
閱讀：1911 發(fā)布時間：2021-8-16摘要：為了加速和簡化常規(guī)實驗室食品檢測，開發(fā)了一套用于定量分析 510 種農(nóng)藥殘留的 全面 LC/MS/MS 工作流程。基于安捷倫農(nóng)藥動態(tài) MRM 數(shù)據(jù)庫開發(fā)了化合物離子對 和優(yōu)化參數(shù)，該數(shù)據(jù)庫擁有超過 750 種農(nóng)藥，包括用于快速、輕松地輸入分析方法 中的精選參數(shù)。工作流程包括樣品前處理、色譜分離、質(zhì)譜 (MS) 檢測、數(shù)據(jù)分析和 解析。結(jié)合使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)與 Agilent 6470 三重四極桿液 質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對三種不同含量類型的食品基質(zhì)：番茄（高含水量）、小麥（高淀粉含 量）和橄欖油（高含油量）進行分析，從而證明該工作流程的適應(yīng)性。使用 Agilent QuEChERS 試劑盒和 dSPE 凈化對番茄和小麥樣品進行樣品前處理。使用 QuEChERS 試劑盒進行萃取，然后通過 Agilent Captiva EMR-Lipid 凈化制備橄欖油樣品。 根據(jù) SANTE/12682/2019，基于檢測限 (LOD) 和定量限 (LOQ)、校準曲線線性以及回 收率和精密度，使用 1–100 µg/L 的基質(zhì)匹配校準標樣對工作流程性能進行評估和驗 證。超過 95% 的分析物表現(xiàn)出優(yōu)異的線性（R2 ≥ 0.99，校準曲線的繪制濃度從 LOQ 到 50 或 100 µg/L）。使用回收率重現(xiàn)性 (RSDr) 和實驗室內(nèi)重現(xiàn)性 (RSDiR) 評估方法 精密度。對 3 種基質(zhì)濃度為 1、5 和 10 µg/kg 的強化質(zhì)量控制 (QC) 樣品進行評估。 90% 的化合物在 10 µg/kg 濃度下的 RSDr 和 RSDiR 均在 20% 的限值內(nèi)。番茄、小麥 和橄欖油基質(zhì)的方法性能證明了該方法適用于高含水量、高含油量和高淀粉含量基 質(zhì)以及可能對其他食品基質(zhì)的使用產(chǎn)生影響的多殘留農(nóng)藥的定量分析。
前言： 在生產(chǎn)、儲存和運輸過程中，用于保護作 物免受疾病或有害生物侵害的農(nóng)藥具有潛 在的毒性。蔬菜、水果、草藥、蜂蜜、油 籽、谷物和動物源性食品等商品內(nèi)部或表 面的農(nóng)藥殘留也會對健康造成不利影響并 引發(fā)環(huán)境問題。世界衛(wèi)生組織 (WHO)、 糧食和農(nóng)業(yè)組織 (FAO)、美國國家環(huán)境保 護局 (EPA) 和歐盟 (EU) 等組織已經(jīng)制定 并發(fā)布了政策聲明，以指導(dǎo)農(nóng)業(yè)組織正確 使用農(nóng)藥。例如，根據(jù)歐盟法規(guī)，最大殘 留* (MRL) 是指在使用農(nóng)藥時，食品 或動物飼料內(nèi)部或表面所含法律容許農(nóng)藥 殘留的高水平[1]。食品中允許的農(nóng)藥殘 留量必須盡可能低，從而確保消費者的食 品安全。除明確禁用的化合物外，大多數(shù) 農(nóng)藥的 MRL 為 10 µg/kg (10 ppb)。這表 明對食品基質(zhì)中多殘留農(nóng)藥的高靈敏度分 析方法的需求。高效液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜 (LC/TQ) 的聯(lián)用是一種得到廣泛認可的現(xiàn)代技術(shù)， 可用于多種農(nóng)藥的定量分析。這是因為 它具有高靈敏度、選擇性和準確度，可 確保獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，滿足復(fù)雜食品 基質(zhì)的 MRL 要求。我們開發(fā)了全面的 LC/MS/MS 工作流程，用于準確、可靠 地分析各種植物源性食品基質(zhì)中的 500 多種農(nóng)藥殘留。該工作流程包括樣品前處 理、色譜分離和 MS 檢測目標定量和結(jié)果 解析，有助于簡化常規(guī)農(nóng)藥分析，從而提 高實驗室通量和分析效率。 安捷倫提供 LC/TQ 方法以及包含樣品前 處理、采集和數(shù)據(jù)分析步驟詳細信息的方 法方案[2]。
實驗部分 化學(xué)品與試劑 使用安捷倫LC/MS液質(zhì)聯(lián)用級乙腈 (ACN)、甲醇 (MeOH) 和水進行研究。LC/MS 級甲酸 和甲酸銨購自 Sigma-Aldrich。使用的所 有其他溶劑均為 HPLC 級且購自 SigmaAldrich。 標樣和溶液 即用型和定制預(yù)混合農(nóng)藥標準品購自表 1 中列出的供應(yīng)商[3]。 用 ACN 和儲備標準溶液制備由 510 種濃 度為 1000 µg/L 的目標化合物組成的中間 標準混合物，并用于其余的實驗。稀釋中 間標準溶液得到 50 µg/L 和 500 µg/L 的 工作標準溶液，用于制備預(yù)加標 QC。
用 ACN 制備校準標樣溶劑，用于評估基 質(zhì)效應(yīng)[1]。對 1000 µg/L 的中間標準品進 行連續(xù)稀釋，制備濃度分別為 1、2、5、 10、25、50 和 100 µg/L 的七種校準溶 液，置于 Eppendorf 離心管中。校準標樣 溶液必須新鮮配制，如果不立即使用，應(yīng) 儲存在 4 °C 的冰箱中。
樣品前處理 無農(nóng)藥和有機標記的新鮮番茄、小麥粉和 橄欖油購自當?shù)仉s貨店。用家用攪拌器將 番茄攪打均勻，如果不立即分析，則將其 儲存在 4 °C 的冰箱中。 以下產(chǎn)品和設(shè)備用于樣品前處理： • Agilent QuEChERS EN 萃取試劑盒 （部件號 5982-5650CH） • Agilent QuEChERS 通用分散式固相 萃取試劑盒（部件號 5982-0028） • Agilent Captiva EMR-Lipid 過濾柱， 6 mL（部件號 5190-1004） • 安捷倫正壓處理裝置 PPM-48（部件 號 5191-4101）• Geno/Grinder (SPEX, Metuchen, NJ, USA) • 離心機（Eppendorf，離心機 5804R 和 5430R） • 渦旋儀和多管渦旋儀 (VWR, Plainfield, NJ, USA)
分別稱取 10 ± 0.1 g 均質(zhì)新鮮番茄、 2 ± 0.1 g 干燥的小麥粉和 5 ± 0.1 g 橄欖 油，置于 50 mL 試管中。通過加標適 量的農(nóng)藥標準工作溶液，得到預(yù)加標的 QC 樣品，從而制備 1.0 µg/kg 的低濃度 QC (LQC) 溶液、5.0 µg/kg 的中等濃度 QC (MQC) 溶液和 10.0 µg/kg 的高濃度 QC (HQC) 溶液。在將標準品加入基質(zhì) 后，將樣品蓋緊，進行渦旋混合，并平 衡 15–20 分鐘。建議在萃取前向干燥的小麥粉中加水，提高低含水量商品的萃取 效率。使用 QuEChERS 萃取和通用 dSPE 凈化進行番茄和小麥樣品的前處理，而使 用 Captiva EMR-Lipid 凈化進行橄欖油樣 品的前處理，并使用安捷倫正壓處理裝 置 PPM-48 進行輔助洗脫。前處理流程如 圖 1 所示。
基質(zhì)匹配校準標樣前處理 本研究使用并前處理基質(zhì)匹配校準標樣 （后加標標準品），進行工作流程性能的 評估。使用未加標的番茄、小麥和橄欖油 空白樣品制備基質(zhì)空白。基質(zhì)匹配校準標 樣的制備方法與溶劑標準品相同，只是用 相應(yīng)的基質(zhì)空白代替 ACN 溶劑。通過比 較基質(zhì)匹配標樣與相應(yīng)溶劑標準品中的響 應(yīng)來評估基質(zhì)效應(yīng)[1]。
儀器 使用安裝于 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)中的 Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 × 150 mm, 1.8 µm 色譜柱（部件號 959759-902）進行色譜 分離。 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)的各個模塊 包括： • Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G4220A) • Agilent 1290 Infinity II 自動進樣器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity II 柱溫箱 (G1316C) 液相色譜系統(tǒng)條件列于表 2。 配備安捷倫噴射流 (AJS) 電噴霧離子源的 Agilent 6470 LC/TQ 質(zhì)譜儀在動態(tài) MRM (dMRM) 模式下運行。LC/TQ 自動調(diào)諧 在單元和寬模式下進行。使用 Agilent MassHunter 軟件（8.0 或更高版本）完 成所有數(shù)據(jù)的采集和處理。6470 LC/TQ 參數(shù)列于表 3。
結(jié)果與討論 LC/TQ 方法的開發(fā) 這項研究的主要工作在于開發(fā) 510 種農(nóng)藥 化合物的動態(tài) MRM 離子對。對于每種化 合物，使用 Agilent MassHunter Optimizer 軟件通過流動注射對 MRM 離子對以及碎 裂電壓、碰撞能量和電離極性進行了優(yōu) 化。針對每種化合物，自動選擇四種豐 度高的產(chǎn)物離子。dMRM 方法存儲了 來自 510 種農(nóng)藥的 1000 多個 MRM 離子 對。根據(jù)單個化合物的碎裂行為，每種農(nóng) 藥選擇兩個或三個目標特異性 MRM 離子 對（EPTC 和腐霉利除外，它們只有一個離子對足夠穩(wěn)定，可以被監(jiān)測）。這樣做 是為了滿足通過 LC/MS/MS 進行鑒定和確 認的法規(guī)要求[1]。兩個豐度高的碎片被 定義為在保留時間窗口內(nèi)采集的主要離子 對，隨后被用作定量離子和定性離子。 使用 ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 色 譜柱優(yōu)化色譜方法，在 20 分鐘 HPLC 梯 度內(nèi)實現(xiàn)了 510 種農(nóng)藥殘留的良好分離和分布。使用 AJS 離子源，0.4 mL/min 的流速為目標離子提供了有效的去溶劑 化。使用周期為 500 ms 的 dMRM 方 法。觀察到的典型色譜峰寬在 8–12 秒之 間。圖 2A 顯示了在橄欖油基質(zhì)提取物中 后加標濃度為 10 µg/L 的所有 510 種目標 農(nóng)藥的代表性 MRM 色譜圖。