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血清中的孕酮代謝
閱讀：1015 發布時間：2021-7-28摘要：孕酮及其代謝物對女性具有重要作用，因此常用于激素替代療法。然而目前的研究表明，孕酮（合成孕酮）可在多種疾病中發揮重要作用，尤其是乳腺癌。本文介紹的安捷倫LC/MS/MS 方法采用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜儀和 6495 三重四極桿液質聯用系統，適用于分析孕酮及相關依賴性激素，其中包括孕酮、3α-/5α-/20α-二氫孕酮以及別孕烯醇酮、孕烯醇酮和脫氧皮質酮。
前言：除雌激素外，孕酮及其代謝產物在乳腺癌的發展中發揮著重要作用，會增加乳腺癌的發生風險[1,2]。對乳腺組織和腫瘤乳腺組織的檢查結果顯示有三種孕酮代謝產物參與其中：3α-、5α- 和 20α-二氫孕酮[1,3]。除孕酮外，5α-二氫孕酮還具有促進乳腺癌發展的作用，而另外兩種代謝產物 3α-和 20α-二氫孕酮則會抑制乳腺癌的發展[4]。到目前為止，孕激素和孕酮已廣泛用于激素替代療法，但由于化學性質不同，其作用可能有所相同，可能引起負面的副作用[5]。本文開發的 LC/MS/MS 方法旨在用作一種分析男性和女性血清中激素水平的方式。
標樣配制和校準曲線繪制所有分析物均溶于乙腈中。然后使用乙腈配制濃度為 1 mg/L 的混合物。配制 7 個濃度的標樣，涵蓋 5 ng/L–1 µg/L 的工作范圍。將內標溶于乙腈中制成濃度為1 µg/L 的溶液。由于沒有可用的市售質控品，故用含 0.1% BSA 的 PBS 溶液進行配制。質控品的濃度涵蓋標樣組的中低濃度范圍。
樣品前處理取等量標樣、質控品或血清樣品 (400 µL)，然后加入 50 µL 內標。向樣品中加入 5 mLMTBE，用于提取孕酮代謝產物。然后，將樣品渦旋混合，并在 4700 rpm 下離心5 分鐘。轉移有機上清液，在 45 °C 下用氮氣吹干。用 600 µL 1 mol/L 羥胺溶液 (0.5% NaOH)復溶殘留物，渦旋混合。在 90 °C 下進行衍生化反應，持續 15 分鐘。反應期間，以500 rpm 的轉速振搖溶液。冷卻后，加入5 mL MTBE，渦旋混合物。離心后（5 分鐘，4700 rpm），除去上清液，并在 45 °C下用氮氣吹干。然后用 100 µL 水/乙腈(70%/30%) 復溶殘留物，并轉移至樣品瓶中進行分析。
數據分析采用 Agilent MassHunter 采集軟件(B.08.00) 進行數據采集。采用 AgilentMassHunter 定量分析軟件 (B.08.00) 對數據進行分析。使用所用內標（孕酮-2,3,4-13C3）對所有分析物進行校正，以排除基質效應。
結果與討論LC/MS/MS 方法能夠分離所有孕酮代謝產物，如圖 1 中的示例血清樣品所示。異構體也可成功得到相關分離。
分析驗證顯示，分析內和分析間精度符合要求，所有數值均低于 10%。除定量限 (LOQ) 和線性數據外，精度數據如表 2所示。為檢測 LC/MS/MS 方法，對男性和絕經后女性的血清樣品進行處理和測定。兩個性別相關孕酮的相關激素值和比值結果相似（表 3）。
結論本應用簡報中介紹的 LC/MS/MS 方法可以可靠地測定孕酮及相關代謝產物。達到的LOQ 還有助于在自然孕酮水平較低的男性和絕經后女性中測定這些激素。需要注意的是，樣品前處理過程非常復雜，且會對測定結果產生影響；因此需要格外小心。孕酮和 20α-二氫孕酮的測定結果與文獻值（括號中的值）相當：男性孕酮為48.2 ng/L (42 ng/L)，女性孕酮為 27.9 ng/L(34 ng/L)，男性 20α-二氫孕酮為 58.3 ng/L(39 ng/L)，女性 20α-二氫孕酮為 40 ng/L(40 ng/L)。同樣，5α- 和 3α-二氫孕酮之間的比值與文獻值十分相近（10.9 與 9）[4]。文獻中 3α- 和 5α-二氫孕酮的比值明顯較高，可能是由于使用了另一種內標[4,6]。