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使用Agilent Cary 3500測定丙氨酸氨基轉移酶催化活性濃度
閱讀：993 發布時間：2021-7-13前言：酶催化活性濃度測量是醫學參考實驗室的基礎檢測項目。目前，國際檢驗醫學溯源聯合委 員會 (JCTLM) 已批準由國際臨床化學和實驗室醫學聯盟 (IFCC) 編寫的七種酶（L-丙氨酸 氨基轉移酶 (ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶 (AST)、乳酸脫氫酶 (LDH)、α-淀粉酶 (AMY)、 肌酸激酶 (CK)、γ-谷氨酰轉肽酶 (GGT) 和堿性磷酸酶 (ALP)）的參考方法，即《IFCC 在 37 °C 酶催化活性濃度測量的原級參考方法》。 本研究參照《IFCC 在 37 °C 酶催化活性濃度測量的原級參考方法 第 4 部分：丙氨酸氨基 轉移酶催化濃度測定參考方法》[1]，使用 Agilent Cary 3500 紫外-可見分光光度計對丙氨 酸氨基轉移酶 (ALT) 的催化活性濃度進行監測。該方法中的基本原理是：在 37 °C 的恒溫 條件下，L-丙氨酸與 2-酮戊二酸在 ALT 的催化下生成丙酮酸和 L-谷氨酸，丙酮酸與煙酰胺 腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸和 NAD+ （如以下反應方程式所 示）；然后通過監測 339 nm 下 NADH 的氧化速率（即吸光度的下降速率）來測定丙氨酸 氨基轉移酶的催化活性濃度，二者呈正比關系。 L-丙氨酸 + 2-酮戊二酸 ALT 丙酮酸 + L-谷氨酸 丙酮酸 + NADH + H+ LD 乳酸 + NAD+
丙氨酸氨基轉移酶催化活性濃度測量 本研究采用配備八池四溫區控溫附件的 Agilent Cary 3500 紫外-可見分光光度計進行測 試，儀器的精準控溫功能可以保證每個池位中樣品的溫度均可以滿足 IFCC 規定的 37.0 ± 0.1 °C 的控溫要求。實驗樣品采用標準物質 GBW(E)090282a、GBW(E)090283a 以 及 IFCC 組織的 2020 年度參考測量實驗室外部質量評價計劃 (RELA) A、B 樣本。
基本操作流程如下： 1) 確認測量條件合格（儀器、試劑和環境條件） 2) 打開分光光度計及輔助設備 3) 監測比色杯內溫度達 37.0 ± 0.1 °C 4) 準備試劑和分析溶液，并孵育反應液試劑達 37 °C 5) 在比色杯內加入 2 mL 反應液和 0.2 mL 分析溶液，充分混勻 6) 孵育 5 分鐘達 37 °C，加入 0.2 mL 起始反應液，充分混勻，并 延遲 90 s 7) 監測吸光度讀數 180 s 在正確度驗證實驗中，檢測標準物質 GBW(E)090282a 和 GBW(E)090283a，每份樣本檢測 3 次，計算均值，比較其是否在 標物的靶值 ± 不確定度范圍內；檢測 IFCC 組織的 2020 年 RELA 樣本 A 和 B，每份樣本檢測 3 次，計算均值是否在其等效限內。 結果均列于表 1 中。從中可以看出，所得結果均符合等效限的要 求，表明該方法具有良好的正確度。
使用配備八池四溫區控溫附件的 Agilent Cary 3500 紫外-可見分光光度計測定酶催化活性濃度，在人員和試劑等因素穩定的前提 下，能夠滿足科研和常規測量工作的要求。與傳統的紫外可見分光光度計配置的水控溫/半導體控溫附件相比，Cary 3500 UV-Vis 八池四溫區控溫附件在酶催化反應測試領域中具有以下明 顯優勢：
1) 溫度是酶催化反應過程的重要影響因素。IFCC 參考方法要求將 實驗溫度控制為 37 ± 0.1 °C，如果溫度控制失敗會造成實驗結果 錯誤及昂貴樣品的浪費。傳統多池控溫附件很難將所有池位的溫 度差控制在 ± 0.1 °C，所以經常當作單池使用或者挑出溫差小的 部分池位（2 至 3 個）使用，操作繁瑣，實驗效率低。Cary 3500 UV-Vis 的八池四溫區控溫附件，每兩個池位由一組控溫模塊獨 立控制，相當于同步運行四臺單獨的控溫設備。通過軟件參數設 置，可將每個池位溫度控制在 IFCC 要求的 37 ± 0.1 °C 區間內， 同步完成四個樣品的測試，對于酶參考實驗室進行國際比對工作 的高通量樣品測試需求具有重要的意義 2) 傳統的控溫附件采用水浴循環的方式控溫，噪聲大且溫度升 降的緩沖時間較長，每次實驗前需要留出一定的時間 (> 30 min) 等待溫度平衡。Cary 3500 UV-Vis 采用空冷控溫，升溫速度快， 5–10 min 即可實現溫度平衡。且無需水浴，避免了實驗室噪聲以 及水浴長菌的困擾，用戶體驗度更佳 3) 與此同時，Cary 3500 UV-Vis 采用氙燈光源，光源壽命為 20000 小時以上，控溫模塊采用全新的一體式設計，無任何移動 部件。因此儀器無需任何維護，用戶維護成本低
參考文獻 1. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Scientific Division, Committee on Reference Systems for Enzymes (C-RSE). IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes at 37 °C: Part 4. Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of Alanine Aminotransferase