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摘要：細胞脂肪酸 (FA) 譜被*為各種人類疾病的生物標記物，通常采用安捷倫氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) (GC/MS) 對其進行分析，而這種方法非常費時費力。因此臨床研究中需要一種高通量的分析方法。在本研究中，從紅細胞 (RBC) 中提取 FA 后進行衍生化，以生成脂肪酸甲酯 (FAME)。采用氨氣誘導化學電離 (CI) 的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (GC/MS/MS) FA 譜分析法專為人 RBC 的分析而開發(fā)。有 703 個 RBC 樣品采用 GC/MS/MS 進行了 FA 譜分析。將該分析方法與采用電子轟擊電離 (EI) 的單桿 GC/MS 傳統(tǒng)方法進行比較。氨氣誘導 CI 分析能夠生成足夠數(shù)量的分子離子，以對 FAME 進行進一步研究。該分析確定了 45 個 FA 譜的特定碎片，用于實現(xiàn)可靠的定量分析和碎裂。使用傳統(tǒng) GC/MS 的典型分析時間長達 60 分鐘，但該 GC/MS/MS 分析方法的運行時間僅為 9 分鐘。分析的所有 FA 批間與批內(nèi)變異小于 10%。將氨氣誘導 CI 與 GC/MS/MS 分析相結(jié)合，可幫助臨床研究實驗室實現(xiàn)穩(wěn)定、可靠的高通量 FA 譜分析。

 

前言為了測定臨床研究實驗室中的脂肪酸 (FA) 譜，需要靈敏的特異分析方法。過去分離 FA 譜采用的是氣相色譜 (GC) 結(jié)合火焰離子化檢測器 (FID)，這個組合使研究人員能夠分析不同基質(zhì)中的單個 FA1 。質(zhì)譜 (MS) 的引入改善了這種分析方式2 ，但傳統(tǒng) GC/MS 分析需要長時間的色譜分離才能確保可靠的鑒定和定量。本研究開發(fā)并驗證了一種用于紅細胞 (RBC) 等生物樣本中 FA 高通量分析的特異、快速而靈敏的分析方法。為此，使用化學電離 (CI) 與氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (GC/MS/MS) 結(jié)合來測定 FA。采用這些技術(shù)可得到過去使用 GC/MS 進行 FA 分析的改進方法。

 

化學品與試劑異丙醇、甲醇和己烷（GC 級）購自 Fisher Scientific (Schwerte, Germany)。水（LC/MS 級）和BF314% 甲醇溶液）購自 Sigma-Aldrich (Hamburg, Germany)。硫酸鈉 (Na2SO4) 購自 Merck (Darmstadt, Germany)。經(jīng)認證的 37 種脂肪酸甲酯 (FAME) 混合物 (TraceCERT) 購自 Sigma-Aldrich (Hamburg, Germany)。另一種 FAME 混合物購自 NuChekPrep (Elysian, MN, USA)，包括內(nèi)標 C17:1（十七碳烯酸甲酯）在內(nèi)的所有其他 FAME 均購自 Larodan (Malmö, Sweden)。使用常規(guī)實驗室分析提交的 EDTA 抗凝血液等分試樣。按照 “赫爾辛基宣言 II”向受試者詳細說明，并獲得使用不具名實驗室數(shù)據(jù)的知情同意。

 

樣品前處理為從血紅細胞中提取 FA，將 0.5 mL 全血和 10 mL 0.9% 鹽水混合，并在 2500 g 下離心 5 分鐘。棄去上清液后，重復一次清洗步驟。之后加入 1 mL 蒸餾水使細胞溶解，并在冰箱的低溫條件中儲存至少 30 分鐘。然后將 FA 提取物與 5 mL 內(nèi)標 (IS) 溶液混合，并在 2500 g 下離心 5 分鐘。IS 溶液含有 0.2 mg/mL FAC17:1 己烷/異丙醇 (3:2) 溶液以及 3 mL Na2SO4 溶液 (6.7%)。然后將己烷相轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃管中并用氮氣將樣品蒸干。在分離 FA 時，加入 1 mL BF3 甲醇溶液 (14%) 并在 100 °C 下溫育 10 分鐘進行酯化。然后，冷卻至室溫后，將 1 mL 水和 3 mL 己烷加入樣品中，并在 2500 g 下離心 5 分鐘。將己烷相轉(zhuǎn)移至干凈的樣品瓶中，用氮氣蒸干。終的 FAME 樣品溶于 250 mL 己烷中，可儲存在 –25 °C 條件下。分析前將樣品以 1:20 的比例用己烷稀釋。數(shù)據(jù)分析采用 Agilent MassHunter 軟件進行數(shù)據(jù)采集 (Waldbronn, Germany)。為了對 FAME 進行正確鑒定和定量，用兩個碎片離子，一個用于定量，另一個用于確認。校準標樣中采用 45 種 FAME（表 1）的混合物。將單個 FA 濃度計算為評估的 FA 集合中 100% 的相對百分比，或計算為值。采用 MassHunter 定量分析軟件 5.0 和 MassHunter 定性分析軟件 5.0 進行數(shù)據(jù)分析。使用分析物與內(nèi)標的峰面積比值計算校準曲線。方法參數(shù)為了測定 GC/MS/MS 分析方法的線性和準確性，使用了 45 種 FAME 混標在己烷和混合人紅細胞中的一系列稀釋溶液。方法的準確性同樣用 45 種 FAME 混標在三個不同濃度范圍內(nèi)進行評估。為了評估批內(nèi)精度，對一份人血液混合樣品的 10 個等分獨立樣品進行分析。以相同方式測定批間精度，但將樣品分散在不同天中測定。使用在分析當天配制的校準標樣測定濃度。計算精度的相對標準偏差 (RSD)。對人血樣品的分析靈敏度重復測定 10 次。根據(jù)所選分析物的信噪比 (S/N) 計算檢測限 (LOD) 和定量下限 (LLOQ)。使用 MassHunter 定性分析軟件計算信噪比。

 

結(jié)果與討論 安捷倫GC/MS 分析為比較 EI 和 CI 兩種電離方法，在 FAME 分析中展示了二十二碳六烯酸甲酯（DHA，C22:6n3）的譜圖。圖 1A 中，采用 EI 的 GC/MS 譜圖顯示出大量低質(zhì)量數(shù)碎片。m/z = 67、m/z = 79 和 m/z = 99 等某些碎片是 LC-PUFA 的特征性碎片，而這些碎片不具有化合物特異性。采用 EI 碎裂方式后，通常無法檢出 FAME 的分子離子。相反，采用 CI 時，GC/MS 譜圖中主要的峰為分子離子 ([M+H]+ )，m/z = 343（圖 1B）。氨氣用作 CI 的反應(yīng)氣，因此其他的主要峰為氨加合離子 ([M+NH4] + )， m/z = 360。兩種碎片都具有化合物特異性，因為 MS/MS 模式中消耗的氨（[M+NH4] + & [M+H]+ ）可用作定量離子對。