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如何采用Ostro 96孔樣品制備板提高DBS萃取物的潔凈程度
閱讀：618 發(fā)布時間：2020-12-22引言：干血斑分析法（DBS）在醫(yī)藥行業(yè)正變得愈發(fā)重要。動物實驗所帶來的經(jīng)濟及倫理道德方面的問題，以及在運輸以及儲存生物樣品時所產(chǎn)生的高額費用問題，都使得DBS分析法成為一種頗具吸引力的選擇。DBS 分析法可取得較高的分析物回收率。然而，該技術在去除內(nèi)源性干擾方面收效甚微。以殘余磷脂（PLs）為主的干擾物是生物分析中遇到的主要問題。而LC/MS/MS系統(tǒng)中PLs的蓄積，則是引發(fā)基質(zhì)效應的主要原因。在所有其他問題之中，基質(zhì)效應會以無可預測的方式影響質(zhì)譜響應值，降低分析方法穩(wěn)定性并增加其可變性。Ostro 96孔樣品制備板則可消除99%以上的PLs殘留。Ostro 96孔板可通過使用96孔制備板的形式進一步簡化DBS萃取流程，同時提取分析物、去除磷脂、過濾干血斑紙片。DBS樣品可在孔內(nèi)萃取并稀釋直接進樣到LC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中。該創(chuàng)新方法能夠顯著降低樣品制備時間，并在萃取轉(zhuǎn)化、干燥、復溶過程中避免潛在的分析物流失。在本應用紀要中，我們同時應用了傳統(tǒng)方法和Ostro 96孔樣品制備板方法，對含有利培酮、利培酮羥基化代謝物、 9-OH利培酮及其內(nèi)標氯氮平（圖1）的全血樣品進行了萃取。
實驗部分： ACQUITY UPLC條件色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C18， 2.1×50 mm，1.7 μm 流動相A： 0.1% NH4OH 水溶液流動相B： 50/50 ACN/MeOH 流速： 0.6 mL/min 梯度： 時間 梯度模式 梯度線型 (min) %A %B 0.0 75 25 6 2.0 0.5 99.5 6 3.0 0.5 99.5 6 3.1 75 25 6 3.5 75 25 6 進樣量： 40 μL 進樣模式： 部分環(huán)進樣柱溫： 35 ℃ 樣品溫度： 15 ℃ 強洗針液： 60:40 ACN:IPA＋2% HCOOH 弱洗針液： 95/5 H2O/MeOH 沃特世Xevo TQ-S MS運行條件，ESI + 毛細管電壓： 3.0 V 脫溶劑溫度： 550 ℃ 錐孔氣流速： 150 L/Hr 脫溶劑氣流速： 1000 L/Hr 碰撞池壓力： 2.6×10(-3) mbar MRM通道監(jiān)測，ESI+參見表1
樣品制備條件將20 μL的全血樣品滴在未經(jīng)處理的Whatman DMPK-C血卡上。樣品隨后在室溫下干燥2小時。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm 血斑，分別放置進傳統(tǒng)型DBS 萃取法所需的1.5 mL離心管和 Ostro 96孔板孔中。傳統(tǒng)萃取方法在1.5 mL離心管中進行，使用了250 μL含5%水的甲醇溶液，隨后樣品進行1分鐘渦旋、1分鐘3000 g離心，并終將萃取物轉(zhuǎn)移至96孔板上。使用Ostro 96孔板的萃取則采用單步孔內(nèi)萃取法。在Ostro 96孔板中添加 3 mm干血斑（圖2）。以250 μL 含5%水的甲醇溶液作為萃取溶液，渦旋操作1分鐘、真空操作5分鐘。兩種方法產(chǎn)生的洗脫液都用 250 μL 的水進行稀釋，然后進樣到LC/MS/MS系統(tǒng)中。
結(jié)果與討論：在正離子模式下進行MS分析。鑒于DBS萃取物的直接進樣通常會導*稀釋的樣品，我們采用 Xevo TQ-S以顯著提升系統(tǒng)的靈敏度。這同時也有助于直接進樣，并避免了吹干、復溶過程中可能存在的問題。針對每一種樣品制備方法，我們都比較了磷脂殘留量。為了達成這一目的，我們對單個試管萃取和使用Ostro PLR板孔內(nèi)萃取的DBS進行了比對，對五種磷脂進行了量化。與傳統(tǒng)型DBS分析法相比，Ostro板去除磷脂比例高達99.9%（圖3）。為能直觀展示殘余磷脂，傳統(tǒng)型DBS萃取法和使用 Ostro的孔內(nèi)DBS萃取法所產(chǎn)生的五種不同磷脂的總離子流（TIC）如圖所示（圖4）。當使用Ostro板時，磷脂殘留量幾乎可忽略不計，且無蓄積情況。而當使用傳統(tǒng)型DBS法時，即便出于預防磷脂蓄積的目的，采用高比例有機溶劑進行了1分鐘的清洗，磷脂殘余量依舊顯著，而且在整個過程中都有蓄積。我們進行了半驗證，計算QC樣品濃度不足預期值的15%，滿足法規(guī)標準。9-OH利培酮（圖6）及其母化合物LLOQ在全血中都達到 0.05 ng/mL。標準曲線在3個以上數(shù)量級呈線性，全血中的線性范圍從0.05 ng/mL到50 ng/mL（圖7）。
結(jié)論 ■ 簡便、單步的DBS樣品制備方法 ■ 相較于傳統(tǒng)的DBS萃取技術，去除殘余磷脂含量高達99.9% ■ 采用Xevo TQ-S三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀，獲得高靈敏度 ■ 去除LC色譜柱中PLs的蓄積