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使用液質聯用系統分析未衍生化氨基酸的方法
閱讀：1333 發布時間：2020-12-18摘要 ：本應用簡報介紹了一種針對未衍生化氨基酸分析優化的方法。 氨基酸的極性使其難以進行反相液相色譜分析。然而，親水相互作用色譜 (HILIC) 能保留并分離復雜的氨基酸混合物，同時還具有與傳統反相色譜類似的工作流程。 HILIC 與質譜的組合提供了一種簡單而功能強大的氨基酸分析解決方案。 前言 事實證明，在低 pH 與正離子模式 LC/MS 檢測條件下，采用親水相互作用色譜 (HILIC) 分離未衍生化氨基酸，能夠獲得整體靈敏度和色譜分離性能。Agilent InfinityLab Poroshell 120 2.7 µm HILIC-Z 和 HILIC-OH5 化學鍵合相為氨基酸的 LC/MS 分析提供了兩個理想選擇。二者均可對較 難分離的亮氨酸/異亮氨酸同質異位素以 及多種氨基酸實現*分離。
實驗部分 ：試劑與化學品 所有試劑均為 HPLC 級或更高等級。超 LC/MS 級乙腈購自 J.T. Baker (Center Valley, PA, U.S.A.)。水的凈化處理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系統 (Darmstadt, Germany) 完成。試劑級甲酸（FA，部 件號 G2453-85060）來自安捷倫科技公 司。甲酸銨、乙酸銨、氫氧化銨和氨基 酸標樣購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。氨基酸在使用前于 –70 °C 下儲存。 儀器和材料 • Agilent InfinityLab 接頭 • 色譜柱前端：InfinityLab Quick Connect 快速連接液相色譜接頭 （部件號 5067-5965） • 色譜柱末端：InfinityLab Quick Turn 液相色譜接頭（部件號 5067-5966） • 安捷倫樣品瓶，螺口蓋，棕色，帶書 寫簽，經認證，2 mL（部件號 5182- 0716） • 安捷倫固定螺口蓋，帶 PTFE/ 紅色硅膠隔墊（部件號 5190-7024） • 安捷倫樣品瓶內插管，250 µL，去活 玻璃，帶聚合物支腳（部件號 5181- 8872） Eppendorf 移液器和連續分液器 • 渦旋器和多管渦旋器 (VWR, Radnor, PA, USA) • HDPE 溶劑瓶 (VWR, Radnor, PA, USA) 儀器 • Agilent 1290 Infinity II 二元泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II 樣品瓶進樣器 (G7129B) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B) • Agilent 1290 Infinity 液相色譜系列超 低擴散工具包 (5067-5189) • Agilent MassHunter 工作站軟件 • Agilent 6470 三重四極桿液質聯用系統 • 安捷倫噴射流電噴霧離子源樣品前處理 將氨基酸標準品與水混合至表 1 所列出 的濃度，無需進一步樣品前處理即可直接 分析。 流動相前處理 用水配制 200 mM 甲酸銨儲備液，并用 甲酸將 pH 調節至 3。將水與儲備液按 9:1 稀釋制得流動相 A。將乙腈與儲備液 按 9:1 稀釋制得流動相 B。兩種流動相的 甲酸銨終濃度均為 20 mM。 流動相與玻璃器皿過度接觸會引入離子物 質，干擾并抑制質譜檢測。儲存在玻璃瓶 中的流動相應定期更換，或將玻璃瓶換成 HDPE 瓶。
結論 • 使用 HILIC 在正離子模式 液質聯用LC/MS 條件 下對氨基酸實現了成功分析 • Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-Z 顯示出更好的總體峰形，對天冬氨酸 和組氨酸等堿性更強的化合物更是 如此 • Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-OH5 對酪氨酸、纈氨酸和脯氨酸等早洗脫 峰表現出更高分離度 • 這兩種色譜柱對通常難以分析的亮氨 酸/異亮氨酸同質異位素也實現了基 線分離